According to the epidemiological studies, consumption of contaminated water or food has been associated with waterborne disease which is caused by the pathogens including a wide variety of viruses, bacteria and protozoa. Especially, the Cryptosporidium species and the enteric viruses have been recognized as major causes of waterborne outbreaks. Their incidence and behavior in water environments differ due to the differences in size, structure, composition and excretion by humans or animals. Further complications make it harder to detect for the waterborne pathogens. Therefore the specific detection methods are required for detecting those pathogenic microorganisms. The detection methods for pathogenic microorganisms are basically composed of three steps; concentration, purification and quantification. The filtration is one of the concentration methods used most widely. However, filtration methods have limitations such as low recovery yields and low sampling amount. Recently, a new filtration method using hydroxylapatite (HAP) as a filter media was published. This method has advantages in recovering the concentrated Cryptosporidium oocysts as well as volume of water sample. As a next step, a concentration method for diverse microorganisms is required in the field of water quality monitoring. PCR detection methods have been used to quantify the pathogenic microorganisms because of its sensitivity and quick output, it is often unable to discriminate between intact and damaged virus. The objective of this study was to develop a concentration method by using HAP filtration for Cryptosporidium oocysts (oocysts) and enteric viruses from water samples and to develop a discrimination method between intact and damaged viruses by using ethidium monoazide (EMA)-PCR.

In Chapter 4, the development of HAP filtration was described. This study began with HAP layer filtration formed on a nylon net filter with a pore size of 11 um and applied for concentrating viruses and oocysts, simultaneously. To evaluate the HAP layer, the magnetic beads with size-distribution of 4±1.4μm was used with respect to the mean size of oocysts. The obtained recovery ratios of magnetic beads and oocysts were 98.8% and 72%, respectively,where no oocysts or magnetic beads were detected in the filtrate. From the results, the HAP layer was considered to be a good filter media for concentrating oocysts. To understand the interaction between virus and HAP layer, the samples of viruses (bacteriophage Qβ (Qβ), poliovirus type I (PV1) and murine norovirus (MNV)) were filtered with various conditions. The processes of HAP layer filtration with viruses consisted with three steps; sample filtration, acid rinse and alkali elution. Comparing to the filtrate and the acid rinsed sample, the elution of viruses was observed in the alkali elution. The HAP filtration system was designed as combination of HAP layer and negatively charged membrane with a pore size of 0.45 um. Although the use of HAP layer for concentrating and recovering viruses was not offered good recovery yield, the HAP filtration system showed improved recovery yields in the alkali elution.Finally, the simultaneous concentration was carried out with oocyt and PV1. The mixed sample of oocysts and PV1 was tested for HAP filtration system. As a result, oocysts and PV1 were recovered with 76% and more than 100% of recovery yield from the HAP layer and from the eluant of alkali elution, respectively. The HAP filtration system can be applicable to concentrate, simultaneously, pathogenic protozoa and viruses.

In Chapter 5, the EMA-PCR method was developed to discriminate intact viruses from damaged viruses. The important factors studied in the EMA treatment for viral single-stranded (ss) RNA were the conditions of light irradiation and the EMA dose. The remaining concentration of viral ss RNA was not decreased by only light irradiation dose of the 650 W halogen lamp for less than 5 min exposure. The EMA dose alone did not affect to viral ss RNA in various intensity of EMA dose (0.001 - 10 μg/mL), as well. light exposures (30 - 300 sec) and EMA dose (0.001 - 10 μg/mL) were optimized for the EMA-PCR. Approximately 106 PDU/mL of extracted viral ss RNA could be diminished by 10 μg/mL of EMA dose with 300 sec of light irradiation. Here the conditions of the light irradiation for 3 min and 10 μg/mL of EMA dose were selected. The inhibition effect for RT-PCR by residual EMA was removed by using spin-column gel chromatography with Sephacril S-300. Use of QIAamp(R) Viral RNA mini kit for extracting the viral RNA was also effective showing no remarkable differences between with and without additional purification. The processes of EMA-PCR (light exposure, EMA dose and light exposure + EMA dose) were applied to Qβ, PV1 and norovirus.. From only the EMA dose, no remarkable degradation was observed in plaque assay result. From this result, intact viruses in the sample were stable during the EMA treatment. In the RT-PCR assay results, the decreases in the remaining ratios were observed, which was thought to be caused by the presence of non intact virions in the laboratory stoch solutions. From these results, the EMA treatment with the process of the light exposure and the EMA dose was considered to be able to detect selectively intact viruses when applied to ss RNA virus samples.

EMA-PCR was applied to the thermal treated viruses and compared with conventional RT-PCR. The EMA treatment could reduce the RNA of thermal damaged PV1. The remaining ratios by EMA-PCR, PCR and plaque assay were compared. The observed slope was 0.91 (r2=0.99) by the logarithm of the remaining ratios of the EMA-PCR and the plaque assay, showing a good correlation. On the other hand, low relationship was observed between the remaining ratios of the EMA-PCR and the PCR assay with 0.01 of the slope. The EMA treatment reduced the false positive background of PCR assay such as naked RNA. The thermal treatment was also applied to NoV. The observed remaining ratio was 0.99, 0.86, 0.74, 2.48×10(-3) and 0.88 by PCR assay at 45℃, 55℃, 65℃, 75℃ and 95℃ for 10 min, respectively. In the EMA-PCR, 0.97, 1.17, 0.15, 1.33×10(-5) (detection limit) and 7.42×10(-3) of remaining ratio was observed at 45, 55, 65, 75, and 95℃, respectively. Reduction of NoV RNA may be due to denature of the free RNA of dead viruses by RNase like inhibitor because NoV stock solution was purified from human fecal sample. In conclusion, the EMA-PCR could be used as a tool for quantifying the thermal treated viruses instead of plaque assay.

In this study, HAP filtration system for concentrating pathogenic microorganisms and EMA-PCR for selective detection of intact virus were developed and applied to laboratory scale. Obtained results from those detection methods is required for using as a factor or coefficient for risk assessment.

本論文は、Cryptosporidium and Virus Concentration Method with Hydroxylapatite and Ethidium Monoazid-PCR for Selective Detection of Intact Virus (ハイドロキシアパタイトを用いたクリプトスポリジウムとウイルスの濃縮およびエチヂウムモノアザイドPCRを用いたウイルスの選択的検出)と題し、水中病原微生物の濃縮法の開発ならびに感染力のあるウイルスの選択的検出法について研究したものである。6章で構成されている。

第1章では、水系感染の原因となる病原微生物であるクリプトスポリジウムおよび腸管系ウイルスの水からの濃縮法ならびに検出法について研究する必要性とその目的、ならびに研究の流れを示している。

第2章では、本研究で取り扱う微生物についての概論と、これらの微生物の水中からの検出法および消毒耐性に関する既存の知見をまとめている。また、エチヂウムモノアザイドを用いた選択的遺伝子検出に関する既存の研究についてもとりまとめている。

第3章では、クリプトスポリジウムの顕微鏡による計測法、ポリオウイルスおよびバクテリオファージQβの培養法およびRT‐PCR法による測定法、ノロウイルスおよびマウスノロウイルスのRT-PCR法による検出法を示している。

第4章では、ハイドロキシアパタイト(HAP)を用いたクリプトスポリジウムとウイルスの同時濃縮法の開発を行っている。最初に既報に則して、ハイドロキシアパタイトの20μm径の均質粒子を用いて成層し、その粒子サイズによる排除機構を利用してクリプトスポリジウムの捕捉回収を試みている。クリプトスポリジウムの代替指標として同じ大きさ(4±1.4μm)の磁気ビーズを用いてHAP層における回収率を調べ、72%~98.8%の高い回収率を得ている。次に、同じ装置を用いて吸着・脱着機構を利用してウイルスを濃縮するため、マグネシウム添加およびpHによりウイルス粒子の荷電を変化させ、その挙動を調べている。バクテリオファージQβ、ポリオウイルス、マウスノロウイルスを対象試料とし、マグネシウムを加えてHAP層に吸着させ、その後、酸性溶液およびアルカリ性溶液をHAP層に通した結果、アルカリ性溶液のろ液に多くのウイルスが含まれていたものの、初期の添加量に比して十分な回収率が得られなかったとしている。次に、既存のウイルス濃縮法で用いられている陰電荷膜(孔径0.45μm、ミリポア社HA膜)の上にHAP層を形成させ、クリプトスポリジウムおよびウイルスの同時濃縮を試みた。その結果、クリプトスポリジウムおよびポリオウイルスは添加した量に対し74±22%および140±49%の回収率が得られたとしている。以上の結果より、陰電荷膜とHAPを組み合わせた方法により、クリプトスポリジウムとウイルスの同時濃縮が可能であるとの結論を導いている。

第5章では、エチヂウムモノアザイド(EMA)を用いて損傷を受けたウイルスを排除してからPCR法による定量を行う手法を開発している。EMAは可視光照射によりDNAおよびRNAと不可逆的に反応することを利用した手法である。最初に、EMAによるPCRの阻害、可視光によるウイルス測定結果に対する影響がないことを確認している。次に、むき出しのRNAがPCRにより検出されなくなるEMA処理条件を実験的に求め、EMA濃度として10μg/L、光照射条件として650Wハロゲンランプと試料の距離15cmにおいて180秒の照射において、99.99%以上のRNAが検出されなくなることを見出している。また、同じ条件で精製したバクテリオファージQβ、ポリオウイルスおよびノロウイルスをEMA処理し、培養法及びPCR法によりウイルス濃度を測定し、その結果、PCR法においては、EMA単独あるいは光照射単独では濃度低下が見られなかったものの、EMA処理後には10分の1程度までの濃度低下がみられたとしている。一方、Qβおよびポリオウイルスの培養法においてはEMA処理においても濃度低下がみられなかったことから、ウイルス精製試料には完全な形のウイルス以外にもウイルスのRNAが存在し、それら活性のないウイルスRNAがEMA処理によって低減されたものの、完全なウイルスのRNAはその周囲にカプシドタンパクが存在するためにEMA処理によって影響を受けなかったと考察している。また、この考察は、PCR法による測定値が培養法による測定値よりも大きくなるという従来からの知見と一致することも指摘した上で、EMA処理によって活性のあるウイルスを保持したまま損傷を受けたウイルスの遺伝子を排除することができるため、EMA-PCR法によって感染価のあるウイルスの選択的測定が可能になったとしている。

さらに、ウイルスの熱処理による不活化効果をEMA‐PCR法により調べている。ポリオウイルスおよびバクテリオファージQβを45℃、55℃、65℃および75℃にて10分間保持した試料に対し、PCR法、EMA-PCR法ならびに培養法によりポリオウイルスを測定し、その結果、従来のPCR法においてはウイルス濃度の低減が全く見られなかったものの、EMA-PCR法においては培養法と同じ条件でウイルス濃度の低下が観察されたとしている。このことから、熱処理によるウイルスの不活化において、EMA-PCR法の有用性が確認できたとしている。

第6章は総括であり、本論文の成果を取りまとめて示してある。

以上のように、本論文は、水中の病原微生物の中でも重要な監視対象であるクリプトスポリジウムとウイルスを効率的に濃縮する手法を開発し、分子生物学的手法を用いてウイルスの感染価の有無を判定するためのエチヂウムモノアザイドPCR法の開発及びその有用性の評価を行った研究であり、都市環境工学の学術分野に大いに貢献する成果である。よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。