Introduction:

Although bone is able to heal innately, repair of large bone defects is still a big challenge. The need for osteogenic bone substitutes has led to the development of many bone tissue engineering strategies. By combining different components of the tissue-engineering paradigm (biomaterial scaffolds, cells, and bioactive molecules), the conditions of normal tissue development in vivo may be mimicked to recreate functional and structural tissues in vitro.

In my thesis, my research is mainly focused on bone regeneration using tissue engineering strategy. To achieve this purpose, two aspects of research have been carried out: 1. in vitro mechanism study on new potential bone anabolic compounds; 2. in vivo bone regeneration with several different scaffolds.

I start with the calcium enriched medium which is able to enhance mineralization in vitro. However, high concentration of calcium alone can't induce osteogenic differentiation and bone regeneration. Then I focus on a new bone anabolic drug-icarrin and find that its osteogenic effect was dependent on BMP- and Runx2- signaling pathway. Further in vivo study using a calcium phosphate cement scaffold showed enhanced bone regeneration together with icariin. Meanwhile we have evaluated the new drug's effect on bone remodeling using mouse senescence model. Icariin might be more promising in osteoporosis disease study if the positive data can be achieved. Furthermore, a modified collagen gel-vitrigel was applied for BMP-2 delivery. The system showed a sustained release pattern in vitro and significant new bone formation was observed in vivo.

Results and Discussion:

1.Calcium enriched medium enhances mineralization in vitro but lacks the ability to induce osteogenic differentiation in vitro and bone regeneration in vivo

Previous research in our lab has found that calcium enriched medium is able to induce greatly enhanced mineralization in osteosarcoma cell line (Takagishi et. al. Tissue engineering 2006). Other cells including mouse osteoblastic cell line and mouse primary fibroblasts have been tested here. High concentration of calcium enhances both mineralization and osteopontin mRNA expression in these cells. Enhanced calcium depositions also were observed on gelatin hydrogel and collagen sponge scaffolds with cells cultured in calcium enriched medium. But calcium alone can't induce upregulation of ALP and osteocalcin which is the marker of early and later osteogenic differentiation respectively. Further in vivo study using these scaffolds failed to induce bone regeneration in critical defect. The key transcription factor runx2 has been studied and its expression in MC3T3-E1 cells became upregulated under extremely high calcium condition. But it failed to induce late stage differentiation; we suggest that it is due to inhibition effect of runx2 on late stage osteogenic differentiation.

2.Icariin induce osteogenic differentiation in a BMP- and Runx2- dependent manner in vitro and enhance bone regeneration in vivo

To effectively treat bone diseases using bone regenerative medicine, there is an urgent need to develop safe and cheap drugs that can potently induce bone formation. Here, we demonstrate the osteogenic effect of icariin, the main active compound of Epimedium pubescens. Icariin induced osteogenic differentiation in pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells and mouse primary osteoblasts. Icariin upregulated the mRNA expression levels of the osteoblast marker genes runt-related transcription factor 2 (Runx2) and inhibitor of DNA-binding 1 (Id-1). The osteogenic effect was inhibited by the introduction of Smad6 or dominant-negative Runx2, as well as Noggin treatment. Furthermore, icariin induced mRNA expression of bone morphogenetic protein (BMP)-4. These data suggest that icariin exerts its potent osteogenic effect through induction of Runx2 expression, production of BMP-4 and activation of BMP signaling. Furthermore, combination of icariin and TH synergistically induce osteogenic differentiation to a similar extent as BMP-2 does in MC3T3-E1 cells. Icariin also enhance BMP's osteogenic ability in fibroblast cell line. The anabolic effect of icariin was also confirmed in mouse calvarial defect model. Eight-week-old male C57BL/6N mice were transplanted with icariin-calcium phosphate cement (CPC) tablets or CPC only (n=5) and bone regeneration was evaluated at 4w, 6w and 8w after the operation. Significant new bone formation was observed in icarrin-CPC group at 4w and thickness of new bone increased at 6w and 8w. Obvious blood vessel formation also occurred in icariin-induced new bone. We are now evaluating the effect of icariin on age-related osteoporosis. After 6 weeks IP administration, thickness of trabicular bone of SAMP6 mice were significantly increased in icariin treated group.

3.Application of Type I collagen vitrigel to BMP-2 local delivery

Bone morphogenetic protein-2 is a very promising candidate for the treatment of bone diseases and defects, but more effective therapeutic methods are required due to its instability in vivo. A controlled and localized delivery system of bone morphogenetic protein-2 would be appropriate for effective bone regeneration. Here, we developed a novel delivery system of bone morphogenetic protein-2 using vitrigel (a novel stable collagen gel membrane prepared from vitrified type I collagen) for in vivo bone regeneration. Scanning electron microscopy revealed that the collagen vitrigel formed a tightly woven network with average pore sizes of about 1-2 μm. The vitrigel scaffold delivery system exhibited sustained release of bone morphogenetic protein-2 and more than 80% of the total bone morphogenetic protein-2 was still retained in the vitrigel after 15 days in phosphate-buffered saline in vitro. Bone morphogenetic protein-2-containing vitrigel was transplanted into mouse calvarial defects. The enhanced mechanical strength of the vitrigel made it easier to implant into defects without damage. Obvious bone regeneration was observed in the defects of mice treated with as little as 0.19 μg of bone morphogenetic protein-2 at 4 weeks after the transplantation. The local and sustained delivery system for Bone morphogenetic protein-2 developed in the present study may represent a powerful modality for bone regeneration.

Conclusion

This thesis was focused on small molecular compounds to induce osteogenic differentiation and mineralization. Calcium enriched medium and icariin were studied with different kinds of cells and in vivo experiments were carried out with some biomaterials.

Calcium enriched medium was able to induce greatly enhanced mineralization in osteosarcoma cell line and other cells including mouse osteoblastic cell line and mouse primary fibroblasts. High concentration of calcium enhances both mineralization and osteopontin mRNA expression in these cells. Enhanced calcium depositions also were observed on gelatin hydrogel and collagen sponge scaffolds with cells cultured in calcium enriched medium. But calcium alone can't induce upregulation of ALP and osteocalcin which is the marker of early and later osteogenic differentiation respectively. Further in vivo study using these scaffolds failed to induce bone regeneration in critical defect. The key transcription factor runx2 has been studied and its expression in MC3T3-E1 cells was upregulated under extremely high calcium condition. The highly expressed runx2 inhibited the late stage differentiation and bone regeneration.

A compound isolated from traditional Chinese medicine, icariin was applied to bone tissue engineering. Icariin is a safe and strong bone anabolic agent that may exert its osteogenic effects through induction of Runx2 expression, production of BMP-4 and activation of BMP signaling. Icariin activates BMP signaling at least partly through the induction of BMP-4 expression. However, further studies are required to clarify the molecular mechanism underlying the induction of Runx2 expression by icariin. Combination of icariin and TH induces osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells to the similar extent as BMP-2 does. Icariin also enhances BMP's ability to induce osteogenic differentiation in fibroblast cell line. Two animal models were applied here to study icariin's effect on bone regeneration in vivo. In mouse calvaria defect model, calcium phosphate cement scaffold was used as the drug delivery system which showed a sustained release pattern of icariin in vitro. Icariin plus calcium phosphate cement accelerates bone regeneration at week 4 and week 6 after transplantation. Obvious new blood vessels also appear in the new formed bone. The senescence osteoporosis model using SAMP1 and SAMP6 mice also showed icariin has the ability to enhance bone formation in vivo. Furthermore, the extremely low cost of icariin and its high abundance in nature make it appealing for bone regenerative medicine.

Finally, a novel drug delivery system was established with vitrigel. A delivery system based on collagen type I vitrigel scaffolds released BMP-2 in a sustained manner for at least 15 days. The BMP-2 released from the delivery system retained its biological activity. The extended BMP-2 delivery by the vitrigel scaffolds induced much more effective new bone formation in a calvarial defect model, indicating that the sustained and controlled delivery of BMP-2 increases the bone regenerative efficacy of BMP-2. The local and sustained delivery system for BMP-2 developed in the present study may represent a powerful modality for bone regeneration.

Fig.1. Research Scheme of this thesis.

骨の小さな欠損は自然治癒も可能であるが、事故や疾患などによる骨の大きな欠損の再生には大きな困難が伴う。このような骨欠損を修復するために、チタンなどの金属材料や、多孔性ヒドロキシアパタイトなどのセラミックス材料を用いた骨代替材料がこれまでに開発され、これらの人工骨の移植による治療が試みられているが、生体適合性が低く、骨再生能が不十分であるという課題があった。そこで近年、細胞、その足場材料、骨形成因子などを複合化し、組織工学的アプローチによって作製した培養人工骨が、生体適合性、骨再性能の観点から注目されている。すなわち、生体外の人工的な細胞培養環境下において、足場材料、骨分化・成長因子の適切な組み合わせにより細胞の分化能や骨生成能を制御し、生体内での骨再生過程を模倣することによって、生体適合性、骨再生能の高い培養人工骨を作製する技術の開発が望まれている。

本論文では、細胞として骨肉腫細胞、骨芽前駆細胞、骨芽細胞、間葉系幹細胞、繊維芽細胞などを用い、また、細胞の足場材料としてゼラチンヒドロゲル、コラーゲンスポンジ、コラーゲンビトリゲル、リン酸カルシウムセメントなどを用い、これに骨形成タンパク質やカルシウムイオン、骨疾患治療用漢方薬成分であるハーブ由来フラボノイド配糖体イカリン、ヘリオキサンチン誘導体(TH)などの低分子化合物を添加し、生体外培養系において石灰化能評価ならびに石灰化関連蛋白質であるオステオポンチン(OP)、骨シアロタンパク質(BSP)、石灰化反応促進に係る転写因子であるRunX2、骨誘導分化マーカーである細胞内アルカリフォスファターゼ(ALP)、オステオカルシン(OC)などのmRNA転写レベルあるいはタンパク質発現レベルの詳細な解析を行なっている。さらに、このような組織工学的アプローチによって作製した培養人工骨をマウスに移植して生体内での生体適合性、骨形成能の評価を行い、実用的な培養人工骨作製技術の開発を行ったものである。

本論文は、全5章から構成されている。

第1章では、本論文の意義を明確にするために、本研究の背景およびその目的について述べている。

第2章では、 カルシウムイオンが細胞の石灰化能、骨誘導分化に及ぼす影響を検討している。すなわち、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンスポンジを足場材料に用いて骨肉腫細胞MG63、野生型C57BL/6Nマウスから採取した骨芽細胞POB、繊維芽細胞、骨芽前駆細胞MC3T3-E1などを培養し、培地中に添加するカルシウムイオン濃度を2mMから10mMの範囲で変化させ、石灰化能、各種マーカー蛋白質のmRNA転写レベルに及ぼす影響を検討している。その結果、カルシウムイオン濃度が8mM-10mMの高濃度条件では、足場材料、細胞の種類にかかわらず、石灰化量ならびに石灰化に関連する蛋白質OP、RunX2のmRNAの転写量が著しく向上することを見出している。しかし、骨誘導分化の初期マーカーであるALP、後期マーカーであるOCのmRNA転写量の増加は認められなかったため、高濃度のカルシウムイオンは石灰化を促進するものの、細胞の骨誘導分化には寄与しないと結論づけている。さらに、高濃度カルシウムイオン条件下で骨芽前駆細胞MC3T3-E1をゼラチンヒドロゲル上で培養して作製した培養人工骨と繊維芽細胞をコラーゲンスポンジ上で培養して作製した培養人工骨をマウス頭骨欠損部に移植して生体適合性、骨形成能を評価した結果、ゼラチンヒドロゲルは生体適合性が低く移植部周辺の炎症が誘起され、コラーゲンスポンジの場合には生体適合性が高いものの骨形成能は認められなかった。骨形成能が認められなかった理由として、RunX2を高発現させると骨芽細胞の分化が抑制されることが知られていることから、高濃度のカルシウムイオンがRunX2を高発現させたことが、骨形成抑制の原因ではないかと考察している。

第3章では、フラボノイド配糖体イカリン、ヘリオキサンチン誘導体(TH)などの低分子化合物の骨誘導分化効果について検討している。すなわち、骨芽前駆細胞MC3T3-E1、骨芽細胞POBに対して10(-10) Mから10(-5) Mの濃度のイカリンを添加して培養し、石灰化量、ALP活性、ALP、BSP、OC、RunX2などのmRNA転写量に及ぼす影響を評価している。その結果、イカリン濃度が10(-5) Mの条件下で石灰化量、ALP、BSP、OC、RunX2のmRNA転写量が顕著に増加し、イカリンが骨芽前駆細胞、骨芽細胞の骨誘導分化を著しく促進することを明らかにしている。しかし、強力な骨誘導分化促進作用を有する骨形成蛋白質(BMP-2)を100ng/mL添加した場合と比較すると、RunX2のmRNA転写レベルでは同等の促進効果が得られるものの、OCとBSPのmRNA転写レベルはそれぞれ1/6、1/3程度であった。また、THを10(-6) Mで培地に添加した場合にも骨誘導分化促進作用が見られたが、BMP-2の場合と比較してRunX2、OC、BSPのmRNA転写レベルはそれぞれ1/3、1/6、1/15程度であり、単独の添加による骨誘導分化促進効果はBMP-2に及ばなかった。しかし、10(-5) Mのイカリンと10(-6) MのTHを同時に添加した場合には、シナジー効果によりRunX2、OC、BSPの全てのmRNA転写レベルがBMP-2を100ng/mL添加した場合とほぼ同じレベルまで促進されることを見出している。さらに、イカリンを含有させたリン酸カルシウムセメントを足場材料としてマウス頭骨欠損部に移植するin vivo実験ならびに骨粗鬆症モデルマウスにイカリンを血中投与するin vivo実験において、それぞれ頭骨欠損部における顕著な骨再生、骨粗鬆症モデルマウスの骨量増加が認められたことより、培養人工骨のさらなる骨誘導分化促進効果が、イカリンとTHのシナジー効果によってin vivoでも期待できると述べている。また、イカリンやTHなどの低分子化合物はBMP-2と比較して安定性に優れ、価格も極めて廉価であるため、BMP-2に代わる骨誘導分化促進因子として有望であり、骨再生医療分野への応用が期待できることを指摘している。

第4章では、BMP-2を含浸させた2種類の足場材料、コラーゲンType Iゲルとこれを乾燥してガラス化させたコラーゲンビトリゲルについて、BMP-2の徐放挙動ならびに徐放されたBMP-2生物活性を検討している。その結果、ゲルマトリックスの網目構造の目開きが小さいコラーゲンビトリゲルのほうがコラーゲンゲルよりもBMP-2の徐放速度は遅く、徐放速度は時間とともに指数関数的に減少するものの、15日以上にわたってBMP-2を徐放することが可能であることを明らかにしている。さらに培養液中に徐放されたBMP-2は高い骨誘導分化促進活性を維持していることから、培養液中では1日程度で分解されて失活しやすいBMP-2を、ゲル中で安定化できることを明らかにしている。また、BMP-2を含浸させたコラーゲンビトリゲルをマウス頭骨欠損部に移植するin vivo実験の結果、顕著な骨再生が観察されたため、コラーゲンビトリゲルは培養人工骨用の足場材料として有望であると述べている。

第5章では、本研究の纏めと展望について述べている。

以上、本論文は、フラボノイド配糖体イカリン、ヘリオキサンチン誘導体THなどの低分子生理活性物質を含むコラーゲンビトリゲル、リン酸カルシウムセメントなどの足場材料を用いることにより、生体適合性、骨再生能の高い人工骨をin vitro、in vivoで作製する技術を開発したものである。これらの成果は再生医療分野をはじめとする化学生命工学分野の発展に寄与するところが大きい。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。