Abiotic stresses, such as drought, salinity, extreme temperatures, chemical toxicity and oxidative stress are serious threats to agriculture and the natural status of the environment. Increased salinization of arable land is expected to have devastating global effects, resulting in 30% land loss within the next 25 years, and up to 50% by the year 2050 (Bray et al., 2000; Wang et al., 2003; Mahajan and Tuteja, 2005). Therefore, breeding for stresses tolerance in plants should be given high research priority in plant biotechnology programs. Molecular control mechanisms for abiotic stress tolerance are based on the activation and regulation of specific stress-related genes. In our study, we isolated and characterized several stresses-related genes from Arabidopsis thaliana, rice (Oryza sativa L.) and wild salt-tolerant plant Chloris virgata, to know how these genes respond to abiotic stress and how they conferred on stresses tolerance in yeast cells and plants. The mechanisms of how they involved in the plant stresses tolerance also have been discussed.

(1) Two cysteine proteinase inhibitors (cystatins) from Arabidopsis thaliana, designated AtCYSa and AtCYSb, were characterized. Recombinant GST-AtCYSa and GST-AtCYSb were expressed in Escherichia coli and purified. They inhibit the catalytic activity of papain, which is generally taken as evidence for cysteine proteinase inhibitor function. Northern blot analyses showed that the expressions of AtCYSa and AtCYSb gene in Arabidopsis cells and seedlings were strongly induced by multiple abiotic stresses from high salt, drought, oxidant, and cold. Interestingly, the promoter region of AtCYSa gene contains a dehydration-responsive element (DRE) and an abscisic acid (ABA)-responsive element (ABRE), which identifies it as a DREB1A and AREB target gene. Under normal conditions, AtCYSa was expressed in 35S: DREB1A and 35S: AREB1 plants at a higher level than in WT plants, while AtCYSa gene was expressed in 35S: DREB2A plants at the same level as in WT plants. Under stress conditions (salt, drought and cold), AtCYSa was expressed more in all three transgenic plants than in WT plants. Over-expression of AtCYSa and AtCYSb in transgenic yeast and Arabidopsis plants increased the resistance to high salt, drought, oxidative, and cold stresses. Taken together, these data raise the possibility of using AtCYSa and AtCYSb to genetically improve environmental stresses tolerance in plants.

(2) A cDNA library was prepared from rice (Oryza sativa L.) roots grown in the presence of NaHCO3 stress. A cDNA clone isolated from this library was identified by a homology search as a mitochondrial ATP synthase 6 kDa subunit gene (RMtATP6; GenBank accession no. AB055076). In transformed yeast and tobacco protoplasts, the RMtATP6 protein was localized in mitochondria using the green fluorescent protein (GFP) marker. Analysis of RMtATP6 mRNA levels suggested that the expression of this gene was induced by stress from sodium carbonates and other sodium salts. Transgenic tobacco over-expressing the RMtATP6 gene had greater tolerance to salt stress at the seedling stage than untransformed tobacco. Among the other genes for F1F0-ATPase of rice, some were found to be up-regulated by some environmental stresses and some were not. These data suggest that the RMtATP6 protein acts as a subunit of ATP synthase, and is expressed in response to stress from several salts, with the other genes coding for the subunits of the same ATP-synthase. In Arabidopsis, a 6 kDa protein (At3g46430) has been previously purified from Arabidopsis thaliana mitochondrial F1F0-ATPase. The gene (AtMtATP6; GenBank accession no. AK117680) encoding this protein was isolated from Arabidopsis and characterized. Northern blot analyses showed that the expression of AtMtATP6 gene in Arabidopsis suspension-cultured cells was induced by several abiotic stresses from salts, drought and cold. Over-expression of AtMtATP6 gene in transgenic yeast and Arabidopsis plants increased the resistance to salts, drought, oxidative and cold stresses.

(3) A plasma membrane H+-ATPase (PMA) gene (ChvPMA) was isolated from a wild salt-tolerant plant Chloris virgata. The expression of ChvPMA gene in leaves and roots of Chloris virgata seedlings under salt stress (NaCl, NaHCO3) was examined. The results showed the ChvPMA gene expression was induced by salt stress. The ChvPMA gene was fused to the N-terminus of GFP gene, and transferred into onion epidermal cells for analyses of intracellular localization. The result showed that the ChvPMA protein was found to be in the plasma membrane of ion epiderm. Because the H+-ATPase activity is regulated by a C-terminal auto-inhibitory domain that can be displaced by phosphorylation, we analyzed transgenic yeast expressing either wild-type PMA (ChvPMA) or truncated ChvPMA lacking the C-terminal auto-inhibitory domain (ChvPMAΔC) under high salt and pH conditions. The results showed that over-expression of ChvPMA and ChvPMAΔC in transgenic yeasts increased the resistance to salt and lower pH conditions, especially, the yeast over-expressing ChvPMAΔC showed better growth than ChvPMA at an external pH 4.0 in the presence NaCl. Transgenic Arabidopsis over-expressing ChvPMAΔC also showed the better root growth than that of ChvPMA at an external pH 4.0 in the presence NaCl.

The plant responding to abiotic stress involves many genes and biochemical-molecular mechanisms; therefore, the detailed analysis of each gene how they involved in plant tolerance will be very necessary; however, more careful utilization of specific genes, including targeting to different types of cells and organelles, should result in even greater salt-stress tolerance under true field conditions.

世界の人口増加の傾向は今後も継続すると予想されているが、増加する人口を養うために必要な食料を生産するための耕地の面積は世界的に頭打ちか減少傾向にある。その要因の一つとして、地球環境の変化、不適切な土地利用、環境破壊等によって生じる植物をとりまく不適切な環境条件が、植物に対する環境ストレス(非生物的ストレス)となることがあげられる。環境ストレスの要因としては、乾燥、過湿、冠水、土壌への塩類集積、高温・低温、有毒化学物質の蓄積等があげられるが、植物はそれらのストレスに応答して遺伝子発現を変化させ、ストレスに適応する事により耐性・抵抗性を示す機構を持っている。また、このような機構は植物種、系統、品種によって異なっている。したがって、植物の環境ストレス耐性の機構を解明する事は、環境ストレスに耐性を持つ作物を今後育成するために必要不可欠であり、分子レベルでの機構解明が求められている。

1章の緒論では、研究の背景、意義と目的について述べている。

2章では、タンパク質分解酵素インヒビターの一つである、cysteine proteinase inhibitors をコードする遺伝子を2つシロイヌナズナからクローニングし(AtCYSaおよびAtCYSb)、これらの遺伝子がコードするタンパク質の、環境ストレス耐性に対する関与について検討を行った。まず最初に大腸菌で2つの遺伝子を発現させ生合成されるタンパク質を精製すると、精製タンパク質はタンパク質分解酵素活性を阻害する事から、AtCYSaおよびAtCYSbがタンパク質分解酵素インヒビターであることを確認した。遺伝子発現の環境ストレスに対する応答を明らかにするために、シロイヌナズナ培養細胞および植物体に様々なストレス処理を行い、遺伝子発現の変化について解析した。2遺伝子の発現量は、塩、高浸透圧、低温、活性酸素などにより上昇する事から、AtCYSaおよびAtCYSbはそれら様々な環境ストレスに対する植物の応答に関与すると考えられた。生体内における機能を明らかにするために、2遺伝子を高発現する形質転換酵母および形質転換シロイヌナズナを作成した。環境ストレスに対する耐性を評価したところ、形質転換酵母および形質転換シロイヌナズナの環境ストレス耐性は野生型と比較して明らかに向上していた。これらの結果から、AtCYSaおよびAtCYSbは、環境ストレス条件下の生体内において、ストレス耐性機構が働く際に重要な役割をはたすタンパク質を保護する事により生体にストレス耐性を付与する事が示唆された。

3章では、ミトコンドリアのATP合成酵素の1サブユニットである6kDaサブユニットをコードする遺伝子を、イネ(RMtATP6)およびシロイヌナズナ(AtMtATP6)からクローニングし、これらの遺伝子がコードするタンパク質の、環境ストレス耐性に対する関与について検討を行った。GFPとRMtATP6との融合タンパク質を発現するようにベクターに組み込みタバコおよび酵母細胞に導入すると、GFPのシグナルはミトコンドリアに局在して観察される事から、RMtATP6はミトコンドリアに存在する事が予想された。またRMtATP6およびAtMtATP6の遺伝子発現は、炭酸塩や塩化ナトリウム処理により上昇する事から、ストレスに対する植物の応答に関与すると考えられた。さらに、RMtATP6を高発現する形質転換タバコ、AtMtATP6を高発現する形質転換酵母および形質転換シロイヌナズナは、野生型と比較して塩、乾燥、高浸透圧、低温に対して明らかに強い耐性を持つ事が明らかになった。

4章では、中国東北部のアルカリ性塩類集積地に自生し、アルカリ性塩類に対して極めて高い耐性を持つ野生植物であるChloris virgataから、細胞膜H+-ATPase (PMA) 遺伝子 (ChvPMA) をクローニングし、この遺伝子がコードするタンパク質の、環境ストレス耐性に対する関与について検討を行った。最初に、このタンパク質が細胞膜上に存在する事を、GFP遺伝子と結合させたChvPMAをベクターに組み込み、タマネギ上皮細胞に打ち込んだ後にGFPの蛍光を観察することにより確認した。ストレス処理した植物体における遺伝子発現について解析した結果、ChvPMAは塩処理により発現誘導されることが明らかになった。全長のChvPMAおよびC末端に存在すると予想される自己抑制領域(autoinhibitory domain)を切り取ったChvPMAΔCを高発現する形質転換酵母および形質転換シロイヌナズナを作成した。形質転換酵母では、ChvPMAおよびChvPMAΔC形質転換体の両方で耐塩性と酸性耐性が向上したが、酸性条件での塩ストレス条件化ではChvPMAΔC導入酵母の耐性がより優れていた。同様にChvPMAΔC導入シロイヌナズナは、ChvPMA導入シロイヌナズナより酸性条件下で優れた根の伸長を示した。

以上本論文は、植物の環境ストレス耐性に関与する重要な遺伝子について、詳細な検討を行ったものである。本研究で得られた成果は、環境ストレス耐性を持つ作物を分子育種により作出する際に重要な情報となるため、学術上、応用上貢献することが少なくない。よって審査委員一同は本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。