The liver is a central organ for numerous metabolic functions in adult, whereas it functions as a major hematopoietic organ in the fetal period. Thus the liver changes its characteristics dramatically during development. While some transcription factors have been identified that involve in liver development, the exact regulatory mechanism of liver development is still poorly understood. C/EBPα is a key transcription factor indispensable for the expression of some metabolic enzymes in perinatal liver. However, as C/EBPα is already expressed in fetal liver, the expression of C/EBPα alone does not account for the dramatic expression of metabolic genes, and hence an additional factor(s) is expected to function cooperatively with C/EBPα. Here, I describe collaboration of two transcriptional factors, FOXO1 and YB-1, with C/EBPα to regulate glucose and ammonia metabolism respectively.

Expression of Foxol sharply increased in the perinatal liver and augmented C/EBPα-dependent transcription. Foxol bound C/EBPα via its forkhead domain, and bound to the promoter of a gluconeogenic gene, phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), in a C/EBPα-dependent manner. Insulin is a negative regulator of gluconeogenesis and suppressed the C/EBPα-dependent transcription of PEPCK via inhibition of Foxol.

YB-1, a member of the Y-box binding proteins, was known to play a critical role for expression of genes involved in cell proliferation and drug-resistance. While it is also considered as a tumor marker for hepatocellular carcinoma, the YB-1 function in the normal liver remains unknown. Here, I show that YB-1 regulates ammonia metabolism by modulating transcription of the CPS 1 gene that encodes a key enzyme in urea cycle. YB-1 expression was evident in the liver at embryonic day 14.5, and declined along with liver maturation. Forced expression of YB-1 in fetal liver cells resulted in suppression of CPS1 expression. YB-1 bound to a Y-box in the CPS 1 promoter, down-regulating the transcriptional activity induced by C/EBPα. Moreover, CCl4-induced liver injury up-regulated YB-1 expression, accompanying the suppression of CPS 1 and increase of serum ammonia. Chromatin immunoprecipitation assays showed that YB-1 bound to the CPS 1 promoter in fetal and CCl4-induced livers but not in normal adult liver.

In conclusion, these results indicate that the Foxol and YB-1 molecules contribute to the transcriptional regulation of PEPCK and CPS1 genes by modulating C/EBPα activity.

本論文は7つのChapterからなる。Chapter IでのGeneral introduction, Chapter IIでのMaterials & methodsに続き、Chapter IIIとChapter IVでは研究成果、Chapter VではConclusion、Chapter VIとChapter VIIではAcknowledgementとReferenceが記されている。

申請者の所属する研究室では、肝臓における発生・分化の分子機構解明に向けた研究を展開している。本論文で申請者は、肝細胞の分化、成熟過程における代謝酵素遺伝子の発現調節に着目し、代謝酵素の発現において中心的な役割を果たす転写因子C/EBPαの機能を調節する因子について詳細に解析している。新生児肝臓での様々な代謝酵素発現にはC/EBPαが必須の役割を担うことが知られている。C/EBPα遺伝子欠損マウスでは糖代謝酵素やアンモニア代謝の発現がおこらず、この結果血中glucose濃度が低下する一方、血中アンモニア濃度が上昇し、生後数時間のうちに死亡することが示されている。しかし、申請者らはC/EBPαはマウス胎児14日目肝臓ですでに発現し出生前後でもその発現量に劇的な変化はないことを見いだした。つまりC/EBPαの発現量だけでは、出生前後に起こる代謝酵素の劇的な発現誘導を説明できない。そこでC/EBPαの作用を制御する因子の存在を考え、以下の2つの制御機構を見いだした。

Chapter IIIでは出生時期にC/EBPαと協調して働きC/EBPαの機能を増強する因子としてFoxolを同定した。insulinは成体肝臓中でPEPCKやG6Paseと言った糖新生に関わる酵素の発現を制御することが知られている。本研究は胎児肝細胞培養系でもinsulinが、糖新生に関わる酵素発現を抑えることを明らかにした。そこでinsulin下流の転写因子Foxolに着目し、Foxolが新生児期においてもPEPCKの発現を調節することを明らかにした。この作用はFoxolとC/EBPαが複合体形成し、FoxolがC/EBPαの転写活性を促進することで発揮されることを明らかにした。更に、新生児の肝臓ではC/EBPα-Foxol複合体が標的遺伝子プロモーター上にリクルートされることを確認した。よって本研究により、C/EBPα-Foxol複合体が協調的に糖新生に関わる酵素遺伝子の発現を制御することで肝細胞の分化成熟に機能することが示された。

Chapter IVは、糖代謝酵素と同じように出生時期に劇的に発現が開始するアンモニア代謝酵素CPSlの転写機構を解析している。体内で生成された有毒なアンモニアは尿素回路により、無毒な尿素に変換される。CPSlは尿素回路の最初の反応を触媒する酵素であり、CPSlの発現はC/EBPαに依存していることが知られている。本研究では、C/EBPαの機能を調節する分子が存在する可能性を考えた。そこでまず、肝細胞分化段階の胎児12日目と胎児17日目のDlk+の肝芽細胞をmicroarray解析を行い、胎児12日目で発現し胎児17日目で発現が消失する転写抑制因子YB-1の発現変動に着目した。胎児肝細胞培養系においてretrovirusを用いYB-1を強制発現するとCPSlの発現を抑制することを明らかにした。さらに、YB-1はCPSlプロモーターのC/EBPα結合配列近傍のY-boxを介し、C/EBPα依存的な転写を抑制した。一方、四塩化炭素により障害した成体肝臓においては、一時的にYB-1の発現が上昇する。この時、CPS1の発現は減少しアンモニア代謝能も低下することを明らかにした。以上のことから下記のモデルが考えられた。すなわち、C/EBPαはEl4ですでにCPSlプロモーター上に存在するものの、そのC/EBPα結合配列近傍にYB-1が結合しC/EBPαによる転写を抑制する。一方、分化が進むとともにYB-1の発現が徐々に減少することでC/EBPαに対する転写抑制が解除され,CPSlの発現が開始されるためである。

以上、本研究により、肝細胞の成熟過程における糖新生およびアンモニア代謝において、C/EBPαを中心としそれぞれFoxol、YB-1を介した新たな仕組みが明らかにされた。

なお、本論文ChapterIIIは関根圭輔、小島伸彦、深水昭吉、緒方一博、宮島篤との共同研究、ChapterIVは関根圭輔、中村康司、柳内浩之、田中稔、宮島篤との共同研究であるが、申請者主体となって実験及び考察を行ったもので申請者の寄与が十分であると判断する。したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。