The stochastic transitions in biological systems, the folding-unfolding transition of a single protein and the switching of multiple motor proteins, were studied experimentally. Both of the topics have been fundamental problems in structural and physical biology, however, the dynamical properties are still poorly understood. Recent advances in manipulating or tracking stochastic process of single molecules provide us with the detailed dynamics that may lay behind the complexity of the processes. With the use of these techniques, we can elucidate the fluctuating nature of the stochastic process by following trajectories of individual molecules in time. Our objective is to build detailed descriptions of microscopic dynamics and connect them with the result in ensemble of macroscopic observations to acquire deeper insights into the complex but ordered behavior of biological processes.

In the first part of the thesis, mechanical unfolding and refolding of a single staphylococcal nuclease (SNase) molecule were studied using atomic force microscope (AFM). SNase is a globular protein that shows simple two-state transition between the native and denatured states in biochemical experiments. Although recent experimental and theoretical studies have proposed the presence of multiple-parallel pathways of the SNase folding, there is no direct experimental evidence until now. By applying mechanical force to the single molecule, we found that the native SNase passes through several intermediates at which parts of the native structure were hold as metastable states, in spite of the simple force response without any stable intermediates under the acid-denatured condition. We also developed novel method to investigate refolding intermediates that have been difficult to probe in conventional force measurements. Tracking intermediates during both of the unfolding and refolding processes of single SNase enabled us to obtain more detailed information about the pathway or the stochasticity of conformational dynamics at the single-molecule scale.

In the second part, the switching transition during melanosome transports in Zebrafish melanophore was studied using the image analysis technique. The melanosome transport that is driven by multiple transport systems, three motor proteins and two cytoskeletal tracks, has been studied as a good model system to understand the regulation mechanism of protein activities in cells. Our study focused especially on the stochastic, bi-directional movement of melanosomes at the intermediate phase of the dispersion in melanophores. The image analysis method was applied to track precise positions of single melanosomes. The result was compared with those of chemically-treated cells in which particular transport systems are disrupted selectively. From the microscopic description, we showed that each motor protein changes its kinetic property via the interaction between different motors. Our result suggests that the switching transition is regulated not only by the cell-wide stimuli but also regulated autonomously by interactions between motor proteins to attain the cooperative dispersion of cargoes.

本論文では、タンパク質の構造形成、及びモータータンパク質の活性制御という2つの問題に対してナノメートルスケールの視点から行われた実験的研究が述べられている。これら、テーマは構造生物学、あるいは生物物理学における重要課題であるが、個々の分子を追跡することの技術的な難しさから、これまで現象の動的な性質についてはあまり理解されていなかった。これに対し本論文では、1分子操作技術や画像解析手法を用いて個々の要素の確率過程を同定し、これまでバルクでの研究では得られなかった新しい知見が述べられている。

本論文は3章からなり、第1章では、イントロダクションであり、研究の背景や目的が述べられている。第2章では、原子間力顕微鏡(AFM)を用いてタンパク質の1分子フォールディング過程を研究した結果が示されている。Staphylococcal nuclease(SNase)の単量体の1分子伸張実験を行った結果、天然状態のSNaseは複数の準安定な中間状態を経てunfoldすることが明らかになった。また、力学的unfolding過程において、同程度の負荷(~150pN)で確率的にunfoldすることがわかった。SNaseのunfolding過程が複数の部分構造の確率的なunfoldで表されるという知見は、これまでバルクでの測定では得ることができなかった新しいものである。また完全に変性したSNaseが可逆的にrefoldする過程において、エネルギー順位の近い11個の中間状態を確率的に経ていることがわかった。1分子レベルのunfolding、refolding過程で見られた確率性は、タンパク質の変性経路の並列性を直接的に示すものであり、従来の研究では得られなかった新しい知見である。

論文の第3章では、ゼブラフィッシュの黒色素胞における顆粒運動を画像解析した研究が述べられている。顆粒運動は、3種類のモータータンパク質と2種類の骨格フィラメントを含む輸送系が働くことで担われている。黒色素胞内の顆粒の凝集・拡散に画像解析手法を用いて1顆粒の運動を高い空間分解能で測定し、その確率的運動における各モータータンパク質の役割が調べられた。顆粒の運動を33ms、7nm程度の時間・空間精度で観測した結果、速度分布から3つの運動状態が分離できることがわかった。さらに3つの状態間相互の遷移確率を求めることにより、モーターのスイッチに関わる確率過程を同定することに成功した。さらに、化学処理を行い微小管またはアクチンフィラメントの重合を阻害したところ、拡散過程においてダイニンによる運動がアクチンの阻害で活性化されることがわかった。このことから、微小管からアクチンへの輸送の切り替えには、ダイニンが橋渡しの役割を果たしていることを示唆する結果を得た。ダイニンが相互作用を介して活性制御をするメカニズムの存在を示したことは、細胞内輸送における3種のモーターの協調機構を知る上で重要な知見であると考えられる。

以上のように、本論文は、タンパク質1分子のフォールディング過程と、黒色素胞における顆粒運動を解明し、生物物理学に新しい知見を与えた。よって、博士(理学)の学位を授与できると認める。