Confronted with extracellular signaling molecules or environmental stresses, organisms need to recognize the signaling molecules/stresses and to respond appropriately to them. When organisms respond to extracellular signal, cellular signal transduction networks have important roles to change the cellular behavior.

In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, the High Osmolarity Glycerol (HOG) pathway is essential for adaptation to high osmolarity stress. Activated Hog1 MAPK regulates various aspects of osmo-adaptation, such as the cell cycle, protein translation, gene expression, and the synthesis and intracellular retention of the compatible osmolyte glycerol.

The HOG pathway is activated by either of two functionally redundant upstream mechanisms, termed the SLN1 and SHO1 branches (Figure 1). It is known that an osmosensor for the SLN1 branch is Sln1, a transmembrane histidine kinase that detects turgor changes and generates an intracellular signal. In contrast, neither the osmosensor nor the signal generator for the SHO1 branch was known when I started my investigation, although it was known that a transmembrane protein Sho1 functioned in the upstream of the SHO1 branch.

Recently, it was reported that the transmembrane mucin protein Msb2, whose extracellular domain was highly O-glycosylated, transmitted a signal into a cell following osmotic stress. However, deletion of the MSB2 gene alone did not inhibit activation in the SHO1 branch. Based on these data, I considered the possibility that another factor that is functionally redundant with Msb2 might be involved in the SHO1 branch.

In this study, I carried out a mutant screen in order to identify and clone the putative factor that is functionally redundant with Msb2. Thus, I found that another mucin-like single pass transmembrane protein Hkr1 acts as a functionally redundant osmosensor in the SHO1 branch. Deletion of the HKR1 gene or the MSB2 gene alone conferred no osmosensitivity to yeast cells, whereas activation of the SHO1 branch was completely abolished in a yeast strain in which both the HKR1 and MSB2 genes were deleted.

Hkr1 and Msb2 are single pass transmembrane proteins of 1802 and 1306 amino acids, respectively. Their extracellular domain has three remarkable similarities. First, both have an extended domain of highly Ser/Thr-rich, which has the potential to be highly O-glycosylated. Second, within the Ser/Thr-rich domain, both proteins have tandem Ser/Thr/Pro-rich repeats that is similar to the mammalian mucin repeats. Third, following Ser/Thr-rich domain, there is a highly homologous non Ser/Thr-rich region between Hkr1 and Msb2, which we termed the Hkr1-Msb2 Homology (HMH) domain. There is no significant sequence similarity between the cytoplasmic domains of Hkr1 and Msb2.

To analyze the contribution of each domain of Hkr1 and Msb2 in osmostress signaling, I constructed various deletion constructs of the HKR1 and MSB2 genes and investigated hyperosmotic activation of the SHO1 branch mediated by these mutants. The analysis revealed that the highly-glycosylated extracellular Ser/Thr-rich domain negatively regulates the Hkr1/Msb2 function, whereas the HMH region is essential for signal generation. In contrast, for both proteins, their C-terminal cytoplasmic domain had no obvious signaling function.

Epistasis tests using constitutively-active Hkr1, Msb2, and Sho1 mutants revealed that Hkr1 and Msb2 are the most upstream elements in the SHO1 branch, whereas Sho1 functions downstream of Hkr1 and Msb2. Furthermore, Hkr1 mutants in which extracellular domain are partially deleted exhibited altered kinetic responses to osmotic stimulation, indicating that Hkr1 (and also Msb2) might be an osmosensor that modulates osmosensitivity of yeast. Sho1, although not an osmosensor, is essential to initiate cytoplasmic signaling by transmitting the signal from Hkr1/Msb2.

Unexpectedly, Msb2 can activate the HOG pathway in two different modes. In Mode 1, activated Hkr1 or Msb2 interacts and stimulates Sho1 to generate a cytoplasmic signal. In Mode 2, Msb2 itself generates the cytoplasmic signal. Additionally,Msb2, but not Hkr1, is also involved in cross-talk signaling, which is an inappropriate activation of mating/filamentous growth MAPK pathway following osmotic stress in hog1Δ or pbs2Δ strain.

To further investigate how Hkr1 and Msb2 activate the downstream pathway, I performed a mutant screen to identify novel regulators in the upstream of the SHO1 branch. For this screen, lethality by constitutively-active Hkr1 signaling in the ptp2Δptp3Δ strain, in which negative regulation of Hog1 MAPK was disrupted, was useful. Suppression of this growth inhibition was an excellent system to sensitively detect deterioration in signaling of the SHO1 branch.

In conclusion, I proved that Hkr1 and Msb2 are the most upstream components of the SHO1 branch and are the likely osmosensors. The signaling model of Hkr1 and Msb2 provides a basis for a novel osmosensing mechanism by membrane-associated mucins. Furthermore, using a newly identified gene HKR1, I constructed a good system to detect signaling in the SHO1 branch. This system will be useful for further investigation of the SHO1 branch.

Figure 1 The schematic model of the yeast HOG pathway including recent findings.

本論文は7章からなり、35の図版と107の引用論文を含む。

第1章(Abstract)は本学位論文の要旨である。

第2章(lntroduction)は、8節よりなるイントロダクションである。細胞内シグナル伝達の一般論より説き起こし、浸透圧制御、MAPキナーゼ経路一般、酵母におけるMAPキナーゼ経路、酵母浸透圧応答に係わるHOG MAPキナーゼ経路、シグナル伝達特異性制御機構、ムチン多糖化タンパク質、など本論文に関係のある諸分野を概説している。同時に、本研究開始時点での当該分野の概況を、目下不足している知識やこれから解明すべき問題点の事例を挙げながらまとめ、章を閉じている。短いながらも、シグナル伝達一般から、より具体的なHOG MAPキナーゼ経路の制御機構にわたって、バランスよく解説されており、基礎知識が十分であることを感じさせる。

第3章(Results)は、12節よりなる実験結果である。まず第1節において、ムチン様多糖化タンパク質Msb2およびHkr1が酵母における浸透圧感知に必須であることを示した。第2節においては、Msb2およびHkr1の機能的に重要なドメインの解析を行い、それぞれに正制御領域と負制御領域があることを示した。第3節では、GFP融合タンパク質を利用してMsb2およびHkr1が細胞質膜に局在することを示した。第4節においては、遺伝学的上位性試験によりMsb2およびHkr1がHOG経路SHO1支経路の最上流因子であることを示した。さらに、第5節においては、Hkr1細胞外領域の多糖化ドメインが浸透圧感知に重要であることを示した。第6節においては、Msb2およびHkr1に依存せずHOG経路を活性化できるようなSho1の変異を解析した。第7節では、Msb2によるHOG経路活性化にモード1とモード2の2つの機構があることをみいだした。第8節においては、モード1機構においては、Msb2/Hkr1とSho1の結合が必須であることを示した。第9節においては、ある種の変異株における浸透圧による接合MAPキナーゼ経路の異常な活性化にはMsb2が関与することを示した。第10節においては、Msb2およびHkr1の恒常的活性化変異体がある条件下では生育阻害を引き起こすことを示した。さらに第11節では前節の結果をふまえてHkr1活性化を阻害するような変異株のスクリーニングを行い、その結果をまとめている。最後に、第12節においては、HOG経路のSHO1支経路における負フィードバック制御機構について解析した。

本論文では、数多くの新知見が報告されている。一部例外はあるものの、全般的に実験計画や得られたデータの解釈は緻密であり、最終的なモデルも充分な信頼性がある。酵母における高浸透圧感知機構をこのように詳細に解明した例はなく、きわめて高い意義がある。

第4章(Discussion)は考察である。本論文で解明した酵母ムチン様タンパク質による高浸透圧感知機構について、更に考察を進めている。

第5章(Perspectives)は結論と展望である。未解決の問題点などについて簡潔に述べている。

第6章(Experimental procedures)においては、本論文で使用された実験方法のうち主要なものを述べている。

第7章(Acknowledgement)は謝辞である。

以上述べたように、本論文は、今まで知られていなかったを明らかにするとともに、将来の研究方向をも示唆する、重要な成果であると評価できる。

なお、本論文第3章は、舘林和夫、Hui-Yu Yang、山本勝良、松下勇作、冨田太一郎、今井みどり、斎藤春雄との共同研究であるが、論文提出者が主体となって実験の立案とその実施、データの分析、及び検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。