Tissue-specific gene expression in multi-cellular organisms has been previously considered to be principally regulated at the transcriptional level, but it is now known that post-transcriptional regulation also plays key roles in this process. Phylogenetically conserved 20-24 nucleotide RNAs, designated microRNAs (miRNAs) mediate the repression of target mRNAs by suppressing translation or promoting mRNA decay in animal. More than 500 species of miRNAs have now been identified in human, and have now been also predicted to target roughly 30% of the total coding genes in human. Hence, just as transcription factors, miRNA genes modulate global patterns of gene expression during differentiation, metabolic activation, stimulus response and also carcinogenesis. Consistent with this, miRNAs exhibit unique expression patterns, and participate in various developmental stages in vertebrates. Moreover, some miRNAs are also thought to be oncogenic or anti-oncogenic due to the observation that they are abundant or scarce, respectively in certain human tumors. However, little is currently known how the miRNA gene expression itself is regulated owing to lack of basic information of their gene structure. Global prediction of promoter regions of miRNA genes would allow us to explore the mechanisms underlying gene-regulatory mechanisms involving these miRNAs. To find out evolutionarily conserved regulatory mechanisms that involve vertebrate iRNAs, in this study, a computational approach was first performed to the prediction of promoters of such miRNAs by the use of comparative genomic methods, followed by scrutinizing a specific conserved miRNA system found in the search.

It is speculated that if specific miRNA molecules are involved in evolutionarily conserved regulatory systems in vertebrates, this would entail a high level of conservation of the promoter of miRNA gene as well as the miRNA molecule. By our current screening of putative promoter regions of miRNA genes (miPPRs) on this base, I identified 59 miPPRs that would direct production of 79 miRNAs (Figure 1). It is found that the position of human miPPRs relative to the corresponding miRNAs are significantly shorter when compared with the 20 sets of background observation miPPRs. Moreover, the miPPRs contains relatively higher CpG dinucleotides than that of the background. These results support that the miPPRs are rich in functional promoter sequences. I have also experimentally assessed the prediction of miPPRs, and show that miR-1-2, miR-133a-1, miR-199a-2 and miR-21 are transcribed from the corresponding miPPRs. The miPPRs for miR-146a and miR-126 are also consistent with previous reports.

I have next scrutinize the miR-21 whose promoter was predicted here. miR-21 has been reported to be highly expressed in various cancers and also to be inducible in a human promyelocytic cell line, HL-60, after PMA treatment. To examine molecular mechanisms involved in miR-21 expression, the structure of the miR-21 gene was analyzed by determining its promoter and primary transcripts by primer extension and northern analysis, respectively. While a promoter of miR-21 gene was previously reported, I found that it is incorrect and further showed that miPPR-21 (putative promoter of miR-21) is an authentic promoter. A single precursor RNA containing miR-21 was transcribed just downstream from the TATA box in this promoter, which is located in an intron of a coding gene TMEM49 in the same direction. Importantly, transcription of TMEM49 is completely PMA-independent and all its transcripts are polyadenylated before reaching the miR-21 hairpin embedding region, indicating that miRNAs could have their own promoter even if overlapped with other genes. The mutated reporter analysis of miPPR-21 and the reporter analysis with expression vector containing AP-1 family genes show that miPPR-21 is activated by AP-1 dependent manner. Moreover, performing gel shift assay and ChIP analysis, I show that AP-1 binds the conserved sites in the promoter identified here, and then activates the miR-21 transcription in conjugation with SWI/SNF complex, after PMA stimulation. The previous findings of enhanced miR-21 expression in several cancers may therefore reflect the elevated AP-1 activity in these carcinomas.

I also found a conserved binding site for NFIB in miPPR-21. The reporter analysis further shows that miPPR-21 activation by PMA was canceled out by NFIB, and the ChIP experiment shows that NFIB protein usually binds the miR-21 promoter in HL-60 cells as a negative regulator and is swept off from the miR-21 promoter during PMA-induced macrophage differentiation of HL-60. Importantly, by available algorithms predict that the NFIB mRNA is a target of miR-21. The 2'OMe-RNA mediated inhibition of miR-21 enhanced the protein level of NFIB, and the mutation at miR-21 recognition site in NFIB 3'UTR reporter rescued the repression of its luciferase activity. Since exogenous miR-21 expression moderately induced endogenous miR-21, an evolutionarily conserved double negative feedback regulation would be operating as a mechanism to sustain miR-21 expression (Figure 2). I also found that NFIB gene was also suppressed at transcriptional level after PMA stimulation in HL-60 cells, and also that inhibition of miR-21 only enhanced the protein level, suggesting that the translational repression of NFIB mRNA by miR-21 accelerates clearance of NFIB in parallel with the simultaneous miR-21-independent transcriptional repression of NFIB after PMA stimulation. This suggests that the coherent feed forward loop including miRNA may be implemented for not only fail-safe mechanism but for rapid shut-off of target genes.

Figure 2. Scheme of the double-negative feedback regulation of miR-21 gene

Figure 1. Scheme of the computational prediction of miRNA promoters.

本論文はmiRNA遺伝子プロモータのコンピュータ予測の章とmiR-21遺伝子のフィードバック制御について述べられた章の2章立てで構成されおり、各章はイントロダクション、材料と方法、結果、考察で構成されている。これらに先立ち、全体のイントロダクションも設けられており、miRNA分子の構造的特徴や生合成、機能について現在の知見が説明され、その重要性については転写因子とのアナロジーによって概説されている。

miRNAのプロモータ予測の章において、まずmiRNAプロモータ、遺伝子構造についての説明や配列情報解析に関する背景が「イントロダクション」で述べられている。「結果」では脊椎動物間での保存度に着目したコンピュータ解析法とその成果が解説され、最終的に予測された59のプロモータ (miPPR) に関して統計的解析や実験的解析による検証結果が述べられている。本研究では情報学的な解析に加え生化学的実験によっても予測が精査され実証されているため、他の研究者に有用たる情報を提供している点で評価される。59のmiPPRはゲノム上の位置などの情報が一覧できる表として添付されている。

次章では、予測されたmiPPRの内の一つmiR-21遺伝子に対するプロモータに関する詳細な解析が展開されている。「イントロダクション」においてmiR-21が多くの腫瘍にて発現が亢進していることからが述べられ、miR-21遺伝子自身の制御を解析することが重要な課題であると認識される。本文ではmiR-21の遺伝子構造を同定する詳細な生化学実験が述べられている。興味深いことに以前報告されていた遺伝子構造は誤りであることが明らかにされている。またこのmiR-21遺伝子はTMEM49遺伝子と重複しているにも関わらず同定された独自のプロモータのみによって制御され、同時にTMEM49 mRNAはmiR-21のヘアピン領域に達すること無くpolyAが付加されることが述べられている。miRNAには他の遺伝子のイントロン中に存在するものも多く、これらの発見は今後のmiRNA遺伝子の制御を考える上で非常に重要な知見である。次に同定したプロモータ中の保存された転写因子結合部位に着目することにより、がん遺伝子であるAP-1がmiR-21を活性化することがプロモータ解析やDNA結合解析により明らかにされている。これはmiR-21ががんで高い発現を示すことの原因となっていることを示唆するものであり、重要な発見である。本論文では、さらにNFI結合部位がやはりこのプロモータ内でも保存されていることに着目している。これは転写因子NFIファミリーの一つであるNFIB自身が脊椎動物間で保存された転写因子であり、さらにその遺伝子3'UTR中にmiR-21の結合部位が保存されているためであることが述べられている。プロモータ解析、DNA結合解析によりNFIBはmiR-21のリプレッサーとして機能することが示され、一方でmiR-21に対する阻害剤やレポーター解析によりNFIB mRNAはmiR-21の標的となりその翻訳が阻害されることが示されている。さらにmiR-21の強制発現により内在性のmiR-21の転写が活性化することからmiR-21とNFIBとの間でダブルネガティブフィードバックが形成されていることが明らかにされている。このフィードバック制御はmiR-21の発現を安定化することが予想され、miR-21ががんなどで高い発現を示すことからも重要な発見であると考えられる。最後にHL-60細胞のPMA刺激の経時変化サンプルにおいてNFIBがmiR-21依存的翻訳阻害と同時にmiR-21非依存的な転写抑制を受けることが示された。これから得たパラメータに基づくシミュレーションにより、この様な転写と翻訳の二重の制御によって標的遺伝子の発現抑制時間が短縮されると示唆されることが述べられている。時間軸に着目することにより転写レベル(転写因子)と転写後レベル(miRNA)の多層制御によって標的遺伝子の刺激応答の短縮に効果があることを示唆したことはmiRNAの機能を明らかにする上で意義深いものである。

最後に全体の結論と今後の展望の章において、マイクロアレイ等の解析を通して時間軸に着目したmiRNAの制御系を明らかにする予定であることが述べられている。

なお、本論文におけるmiRNAのプロモータ予測の章は伊庭英夫との共同研究であり、miR-21のフィードバック制御の章は伊庭英夫、伊藤太二、水谷壮利、箕口滋、山道信毅、櫻井浩平との共同研究であるが、全ての実験及びコンピュータ解析が論文提出者によって遂行されており、寄与が十分であると判断する。

したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。