The germ cell is the only cell population that transmits genome information to the next generation. In spite of its importance, only a few genes are identified to be functional for the generation and development of germ cells. nanos homologues encode RNA binding proteins conserved among many organisms and one of gene families implicated in the germ cell development. The mouse genome encodes three nanos homologues, Nanosl-3 in which Nanos3 expression is restricted in germ cells immediately after its formation and the function is essential for the germ cell development. I studied the mechanism of anti-apoptotic function of Nanos3 and the expression of Nanos3 during embryogenesis and in the adult spermatogenesis. In this thesis, I report my accomplishments in three independent chapters: 1) Function of Nanos3, 2) Regulatory mechanisms of Nanos3 expression, 3) Expression of Nanos proteins in adult testis.

Chanter 1. Function of Nanos3

Nanos3 maintains the germ cell lineage in the mouse by suppressing both Bax-dependent and-independent apoptotic pathways

Cell death in the germ line is controlled by both positive and negative mechanisms that maintain the appropriate number of germ cells and that prevent the possible formation of germ cell tumors. In the mouse embryo, Steel/c-Kit signaling is required to prevent migrating primordial germ cells (PGCs) from undergoing Bax-dependent apoptosis. In the chapter 1, I show that migrating PGCs also undergo apoptosis in Nanos3-null embryos. I assessed whether the Bax-dependent apoptotic pathway is responsible for this cell death by knocking out the Bax gene together with the Nanos3 gene. Differing from Steel-null embryos, however, the Bax elimination did not completely rescue PGC apoptosis in Nanos3-null embryos, and only a portion of the PGCs survived in the double knockout embryo. I further established a mouse line, Nanos3-Cre-pA, to undertake lineage analysis and my results indicate that the most of the Nanos3-null PGCs die rather than differentiate into somatic cells, irrespective of the presence or absence of Bax. In addition, a small number of surviving PGCs in Nanos3/Bax-null mice are maintained and differentiate as male and female germ cells in the adult gonads. My findings thus suggest that heterogeneity exists in the PGC populations and that Nanos3 maintains the germ cell lineage by suppressing both Bax-dependent and Bax-independent apoptotic pathways.

Chapter 2. Regulatory mechanisms of Nanos3 expression

Nanos3-3'UTR is required for germ cell specific Nanos3 expression in mouse embryo

The significance of 3' untranslated region (UTR) in the control of gene expression has been demonstrated in many organisms and tissues. In the early embryogenesis of nematodes, fly, fish and frog, several protein expressions are temporally and spatially regulated via mechanisms depending on 3'UTR of maternal mRNAs, which is a critical step to establish the elaborate body patterning. In mouse, 3'UTRs are responsible for the development of specific cell types in neurogenesis, erythropoiesis and spermatogenesis by organizing the timing and region of mRNA translation. Here, I show that Nanos3 mRNA is detected in both germ cells and somatic cells although Nanos3 protein is expressed specifically in germ cells. To investigate the regulatory mechanism of Nanos3 expression, I generated several BAC transgenic mouse lines using BAC modification technologies and assessed whether the expression is altered by the replacement or deletion of elements in Nanos3 gene. The results indicate that Nanos3 is transcribed but the translation in somatic cells is suppressed via mRNA destabilizing mechanism mediated by Nanos3-3'UTR. Surprisingly, even though mRFP was driven by CAG promoter which induce strong and ubiquitous transcription, the addition of Nanos3-3'UTR was effective to restrict mRFP expression in germ cell. In addition, I also find that Nanos3 exons and intron sequences may be involved in the transcriptional regulation. My current study suggests that Nanos3 expression is regulated by multiple mechanisms at transcriptional and translational levels. Moreover Nanos3-3'UTR has a great deal of capability of translational control: it is not only required for the expression of Nanos3 protein in germ cells, but also sufficient for the establishment of germ cell specific expression patterning in the mouse embryo.

Chapter 3. Expression of Nanos proteins in the adult testis

The spermatogonial heterogeneity revealed by their topology and marker expressions including germ cell-specific proteins Nanos2 and Nanos3

Spermatogonial stem cells (SSCs) reside in undifferentiated type-A spermatogonia and contribute to continuous spermatogenesis, by keeping the balance between self-renewal and differentiation to meet the biological demand in the testis. Despite their critical importance, spermatogonia has been characterized principally through their morphology. I herein report a detailed characterization of undifferentiated spermatogonia in mouse testes based on the gene expression profiles in combination with topological features. The detection of the germcell-specific proteins Nanos2 and Nanos3 as markers of spermatogonia enabled the clear dissection of complex populations of these cells. Nanos2 was found to be expressed exclusively in As to A(al4) cells, whereas Nanos3 was detectable in all undifferentiated spermatogonia (As to A(al)) and differentiating Al spermatogonia. In addition, we found that As and A(pr) can be basically classified into three categories: 1) GFRα1+Nanos2+Nanos3-Ngn3-, 2) GFRα1+Nanos2+Nanos3+Ngn3- and 3) GFRα1-Nanos2±Nanos3+Ngn3+, the first of which is most likely to include the stem cell population. Taken together, we suggest from my current data that Nanos2 is involved in the maintenance of stem cells with GFRα1 and Plzf, whilst Nanos3 may function in transit amplifying cells.

In conclusion, my thesis studies clarified mechanisms how Nanos3 maintains embryonic germ cells and how this important gene expression is regulated. In addition, the detail analysis of Nanos expression pattern in adult testes implied the difference in functions between Nanos2 and Nanos3 during spermatogenesis and gave us new insights on the notion of spermatogonial stem cell.

Nanos遺伝子は進化的に高度に保存されたRNA結合タンパク質をコードしており、多くの生物種において生殖細胞の発生に必須である。マウスは3つのNanos遺伝子をもちそのうち2つNanos2とNanos3は生殖細胞の維持に必須であることはすでに報告されていたが、詳細な作用機構は不明であった。鈴木さんは初期胎生期に発現するNanos3の機能とその発現調節機構の解明を目指した研究を行った。またNanos蛋白質の発現を指標にして生後における未分化精原細胞の詳細な解析をも行った。博士論文は3部に分かれている。

第1部ではNanos3の機能解析結果を報告している。

鈴木さんは修士課程で(1)Nanos3(-/-)胚は雌雄ともに不妊となり、その一因はアポトーシスであること、(2)Nanos3とアポトーシス促進因子Baxとのダブルノックアウトでは一部のPGCが生残すること、(3)生残したNanos3-/-Bax-/-PGCは生殖細胞として分化し、成体においても維持されることを明らかにしていた。博士課程では、さらに、BaxによるアポトーシスとNanos3の関係を詳細に解析し、その結果、生殖細胞のアポトーシスにはBax依存的な機構と非依存的な機構があり、Nanos3は両者を抑制することを明らかにした。またNanso3を欠損する細胞が、体細胞に分化する可能性を検討するため、Nanos3 locusにCre recombinase遺伝子をノックインしたマウスNanos3-CrepAを作製し、系譜解析を行った。しかしNos3(Cre/)-Bax(+/*)、Nos3(Cre/-)Bax(-/-)どちらの遺伝子型においても、PGCの移動経路にあたる体壁や腸管にPGC由来の細胞は観察されなかった。これらの結果から、Nanos3はPGCにおいてBax依存的/非依存的アポトーシスの両方を抑制し、PGCの維持と生残に機能していると結論づけた。

第2部ではNanos3の発現制御機構の解析を報告した。

Nanos3は生殖細胞特異的に発現・機能しているタンパク質であるが、鈴木さんはRT-PCRの結果から、Nanos3の転写は体細胞でも行われ、生殖細胞とは異なる転写後調節機構が機能していることを見いだした。そこで、Nanos3-3'UTR依存的な翻訳制御機構があるのではないかと仮定し、(1)内在性のNanos3-3'UTRを持つBAC-Nanos3mRFP-Nos33'UTRと(2)外来性の3'UTRに置換したBAC-Nanos3mRFP-bghpAの2種類のBACトランスジェニックマウスを作製し、胚におけるmRFPの発現パターンを比較した。その結果、Nanos3-3'UTRが体細胞における翻訳抑制に関与することを発見した。また強力なプロモーターを用いてユビキタスに転写を誘導した場合にもNanos3-3'UTRの付加により、体細胞における発現が抑制され、生殖細胞で特異的な発現が見られた。この結果はNanos3-3'UTRが生殖細胞特異的なタンパク質発現パターンをつくるのに十分であることを示唆しており、本研究によって、Nanos3タンパク質の発現制御におけるNanos3-3'UTRの重要性が明らかになった。

第3部では精子形成過程におけるNanos蛋白質の発現解析を報告している。

精巣は一生を通じて精子を産生する器官であり、その機構は幹細胞の自己複製・増殖・分化のバランスを巧妙に保つことで支えられている。鈴木さんは成体精巣におけるNanos2およびNanos3の発現を詳細に観察し、それぞれが未分化型精原細胞に発現していることを示した。さらに、未分化型精原細胞が遺伝子発現の異なる複数の細胞群から構成されていること、Nanos2はその中でもより未分化な細胞群に、Nanos3はやや分化した細胞群に発現していることなどを明らかにした。この結果は、雄生殖細胞の一連の分化過程において2つのNanosが各々異なる働きを持つ可能性を示唆している。また本研究は、これまでの形態的な分類では均一とされていた未分化型精原細胞を各種蛋白質の発現によって明瞭に分類することを可能にした。

以上のように、本論文は、マウス初期胚においてNanos3が生殖細胞を維持する機構の一端を明らかにし、またその蛋白質の生殖細胞特異的な発現には3'-UTRを介したRNAの安定性の制御機構が関与すること、またNanos蛋白質が精子形成過程でその幹細胞集団に特徴的な発現を示すことを世界で初めて明らかにした研究であり、今後の生殖細胞及び精子形成過程の研究の発展に大きく貢献するものと考えられる。

なお、本論文の研究は、津田雅之(高知大学・准教授)、木曽誠(国立遺伝学研究所・技官)、相賀裕美子(国立遺伝学研究所教授・東京大学教授)との共同研究であるが、論文提出者が主体となって、実験を計画し、遂行したもので、論文提出者の寄与が十分であると認める。従って、博士(理学)の学位を授与できると認める。