Reef-forming scleractinian corals harbor endosymbiotic dinoflagellates in the genus Symbiodinium spp. (referred to as zooxanthellae) in their endodermal cells and build the structural and trophic foundation of coral reefs in the tropical and subtropical zones. The symbiotic relationship is crucial for the coral life, as extended loss of zooxanthellae (coral bleaching) due to physical stress or bacterial infection is fatal to the host. In addition to the role for survival, zooxanthellae cells also enhance the growth rate of the host coral through increased calcification rate of the host skeleton. It is apparent that zooxanthellae transfer photosynthetic products to the host tissue to maintain endo-symbiosis. In return, zooxanthellae receive inorganic and organic nutrients from the host metabolites including sulfate, ammonium and phosphate. However, the mechanism of endo-symbiosis remains largely unknown, particularly at the molecular level, in the reef-forming scleractinian corals. Therefore, I aimed to identify coral genes that are involved in endo-symbiosis of zooxanthellae by comparing mRNA expression between symbiotic and aposymbiotic corals and to assess the function of some genes in the symbiosis.

As an initial step for this purpose, I established a culture system of the coral polyp to which cultured monoclonal Symbiodinium was infected. In this system, I could culture the polyp without symbionts (aposymbiotic coral juvenile) for extended days. Two Symbiodinium cells (PL-TS-1 and CCMP2467 strains) are shown to be effective for acceleration of polyp growth. Therefore, I compared the gene expression profiles among aposymbiotic, PL-TS-1-inhabited and CCMP2467-inhabited corals to identify the genes that respond significantly to endo-symbiosis. High coverage expression profiling (HiCEP) methods was applied to the juvenile coral inhabiting Symbiodinium cells for 20 days. In total, 25 genes were identified as symbiosis-related genes, of which 11 increased and 14 decreased in the symbiotic corals. The change of the expression level was confirmed by the quantitative RT-PCR. The genes were annotated by the homology search using the Blastx program. Annotated genes could be categorized according to their function; 1) lipid metabolism, 2) ion transport, 3) cell signaling, and 4) bone morphogenesis. These results suggest that several genes are involved in endo-symbiosis by changing the metabolism and growth of the host corals.

Among the identified genes, I chose the sulfate transporter gene and performed further analysis to assess its function in endo-symbiosis. Because mucus and skeleton of corals are known to contain sulfate glycosaminoglycans, sulfate transporter may have important regulatory roles in bone morphogenesis and mucus production that are up-regulated by the endo-symbiosis. The determination of the whole cDNA sequence and subsequent molecular phylogenetic analysis of the precursor protein strongly suggested that the identified sulfate transporter is an ortholog of SLC26A11, a Na+-independent sulfate transporter, of vertebrates and invertebrates. The antiserum was raised against the coral protein and localization of the transporter was examined in the host coral. It was shown that the immunoreactive sulfate transporter was localized in mucus cells and the tissue between the coelenteron and skeleton. These results suggest the possibility that the sulfate transporter protein is involved in the uptake of SO4(3-) for synthesis of sulfated macromolecules that are necessary for the formation of calcified skeleton and mucus. These expression analysis and functional analysis provide useful information for future investigation of the molecular mechanisms involved in coral-zooxanthellae symbiosis.

本論文の基本構成は、Abstract, General Introduction、Chapter 1, Chapter 2、およびGeneral Discussionの5部からなる。本論文の特色は、(1)High coverage expression profiling (HiCEP)法という新しい遺伝子発現解析の手法をサンゴに初めて適用することによりサンゴと褐虫藻の細胞内共生に関わる候補遺伝子を単離したこと、及び、(2)共生により発現が増加する硫酸イオントランスポーターについて調べることにより細胞内共生における硫酸イオン輸送の重要性を初めて明らかにしたこと、にある。サンゴと褐虫藻の細胞内共生について遺伝子レベルでの報告例は少なく、その仕組みは未だ明らかではない。本研究により、サンゴと褐虫藻の共生関係を研究するうえで分子生物学的な手法が有用であることを、サンゴ研究者に広く認識させたといえる。

Chapter 1では、クローン化した褐虫藻を共生させた稚サンゴと褐虫藻を持たない稚サンゴを用いて、HiCEP法による遺伝子発現解析を行った。さらにリアルタイムPCRにより、遺伝子発現の違いを確認した。その結果、HiCEP法は極めて信頼性の高い方法であり、共生時に発現が変化する遺伝子を25種類同定した。その結果、脂質代謝に関わる遺伝子(Lipase, Perilipin)、イオン輸送に関わる遺伝子(Sulfate transporter, Na/K ATPase)、電子伝達系に関わる遺伝子(NADH-Ubiquinon oxidoreductase)等が同定され、これらの働きをもつ遺伝子が細胞内共生に関与する可能性が示された。

Chapter 2では、サンゴの硫酸イオントランスポーターに注目してその機能について調べた。遺伝子の全長を用いた配列解析、特異的な抗体を用いた免疫組織学的解析、(35)SO4を用いたオートラジオグラフィーを行い、この分子が細胞内共生にどのように関与しているかを調べている。本研究により、硫酸イオントランスポーターは骨と腔腸の間の内胚葉細胞と粘液細胞に局在することが示された。さらに、サンゴの骨周辺の組織と外胚葉、褐虫藻の周辺に硫酸イオンとして取り込まれた(35)Sが存在していることが確認された。トランスポーター遺伝子の発現が昼と夜で差があり、(35)Sの取り込みが光により促進されることから、硫酸イオンの輸送は褐虫藻の光合成により促進されていることが示唆された。以上の結果から、褐虫藻が細胞内共生することで硫酸イオンの輸送が促進され、粘液や骨格に含まれる硫黄化合物の合成が促進されると考えられる。そして、サンゴの硫黄化合物の合成には褐虫藻が重要であることが示された。このように、本研究はサンゴと褐虫藻の細胞内共生について新しい知見を与えるものである。

なお、本論文のChapter 1、2の研究はサンゴの採集などにおいて阿嘉島臨海研究所や琉球大学にお世話になったが、実験はほとんど全て論文提出者本人が行ったものであり、本論文の全ての研究において論文提出者の寄与が十分であると判断する。

したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。