Flexizymes are artificial RNA catalysts that facilitate the acylation of tRNAs with highly flexible to both structure of its substrates and kinds of tRNAs. The de novo acylation system based on flexizymes allow us to synthesize a wide variety of mis-charqed tRNAs with virtually no limitation. On the other hand, assignment of amino acid substrates to tRNA in situ, in translation apparatus have not been demonstrated because of no specificity for tRNAs. Here we construct in situ generation system of aminoacyl-tRNAs based on ribonuclease P (RNase P) and catalytic precursor tRNAs that have flexizyme sequences in 5' reader regions. The self-aminoacylation of catalytic precursor tRNA and its maturation by RNase P enable to specifically assign amino acid substrate to a tRNA in E.coli reconstituted cell-free translation system. The de novo assignment system described here demonstrated to assign 11 kinds of non-proteinogenic substrates to an anticodon in translation apparatus, indicating this system can express various non-proteinogenic peptide with one series of biocatalyst. Additionally aminoacvl-tRNAs could be generated by using the DNA template of catalytic precursor tRNA. Thus, de novo assignment system described here opens a new avenue for the application of flexizyme in vivo. Furthermore, I improved the environmental problem of flexizyme system. Previous flexizyme systems have been required relatively high Mg(2+) concentrations (>50 mM) for the full function. For instance, lowering the Mg(2+) concentration to~1 mM, where the in vivo translation system generally functions, resulted in significant decrease in activity. To overcome this limitation, we implanted a new random domain into a part of flexizyme to aim at selecting a new functional domain that would exhibit acylation at lower Mq(2+) environment such as in vivo translation apparatus. After the selection of new accessory domain, mutations were further introduced for selected ribozyme to optimize the extra sequences of putative catalytic core. Indeed, in vitro selection of active species from such an RNA pool afforded a new flexizyme, called mdFx showing 10 fold improvement of Mg(2+) dependency. Thus, this new flexizyme opens a new avenue to construct a de novo aminoacylation system of tRNAs in vivo.

本研究は、人工RNA触媒を翻訳系内で機能させることを主たる目的とした研究である。第一章において、これまで行われてきた人工RNA触媒のエンジニアリング研究に関する内容を明らかにし、当研究の位置づけを明らかにした。第二章では、無細胞翻訳系内における新規アシルtRNA合成系の構築を行なった。これによって、これまで多分子系内で機能させることができなかった人工RNA触媒を翻訳系内で機能させることに成功している。さらに特殊構造を持つ様々なアミノ酸をtRNAに対応付けることを可能にした。従って、「多分子系内における人工RNA触媒の応用」という従来達成されていなかった研究課題の解決を行った。第三章では、新たに構築した合成系を細胞内へ応用するための基礎研究を行った。RNA触媒の触媒中心以外の配列に注目し、新たな新規ドメインを付加することでマグネシウム依存性の改善を行った。題四章では、本研究によって得られた結果を要約し、2章、3章で得られた研究成果を組み合わせることでどのようなことが期待されるのかを明らかにした。

よって、本研究は「多分子系内における人工RNA触媒の応用」と「低マグネシウム環境における触媒活性の向上」という課題を解決することで、RNA触媒の応用性を広げ、RNA工学、特殊ペプチドの合成分野において大きく貢献できると考えられる。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。