Epigenetic mechanisms, which involve DNA and histone modifications, result in the heritable silencing of genes without a change in their coding sequence. Study of human diseases have been focused on genetic mechanisms, but expanding studies have shown that disturbance of the balance of epigenetic networks can cause diseases, including cancers, mental retardations and abnormal development. Thus, reversing the abnormal epigenetic alterations has offered a great potential of developing epigenetic drugs in the clinical field. However, such development has overseen the hidden pitfalls regarding the drug usage on patients, mainly on the non-specificity effect on genomic regions and biological mechanisms.

One of the epigenetic drugs, 5-aza-2'-deoxycytidine (5azadC) or decitabine, has recently approved for several malignancies. 5azadC is known to exert its effect by inhibiting DNA methyltranserases (Dnmt), constraining the enzymatic activities and results in unmethylated DNA after several replications. There are several kinds of Dnmts, each has specific preference on genomic regions. Besides, growing evidence shows direct linking of histone modification enzymes to DNA methylation and Dnmt to histone modifications. These have raised concerns on its inducing effects, in addition to DNA demethylation.

This thesis addressed questions regarding the potential of 5azadC to induce non-targeted effect on different genomic regions and on other epigenetic modifications. Understanding of such behind mechanisms is imperative to develop better therapies for disease treatment.

Chapter 1 - Resistance of Genic Regions against 5-aza-2'-deoxycytidine Compared to Non-genic Repetitive Sequences

5-aza-2'-deoxycytidine (5azadC) has been widely used as a Dnmt inhibitor to reverse aberrant hypermethylation. 5azadC exerts its demethylating effect by covalently binding to Dnmts. As Dnmts have multi targets, there is potential of causing genome-wide demethylating effect by using 5azadC and risk of demethylating non-targeted genomic regions might occur. In addition, there are diverse interactions between DNA methylation and histone modification in euchromatic and heterochromatic regions. Possibility to induce hypomethylation-independent activation of gene expression and downstream responses might exist. This chapter studies the effect of 5azadC on non-genic repetitive sequences and some genic regions including T-DMRs.

Considering the potential effect of 5azadC on non-targeted genomic regions in normal cells, i investigated its effect on repetitive sequences and selected gene loci, Oct-4, Sall3, Per1, Clu, Dpep1 and Igf2r, including tissue-dependent and differentially methylated regions, by treating mouse NIH/3T3 fibroblast cells with concentrations of 5azadC ranging from 0.001 μM to 5 μM. Demethylation of minor satellite repeats and endogenous viruses was concentration dependent, and they were strongly demethylated at 1 and 5 μM. In genic regions, methylation level decreased only at 0.1 μM, but was minimally altered at concentrations lower or higher, regardless of the abundance of CpG sites. Thus, repeats are strongly demethylated, but genic regions are only demethylated at effective doses.

Genes were activated by 5azadC treatment, and were accompanied by a unique combination of histone modifications in genic regions, including an increased level of H3K9me3 and a decreased level of AcH3. Increase of H3K9me3 in genic regions was not observed in Dnmt knock out cells. I identified differential effects of 5azadC on repetitive sequences and genic regions, and revealed the importance of choosing appropriate 5azadC doses to achieve targeted gene recovery and to minimize side effects in patients receiving cancer treatment.

Chapter 2 - Epigenetic Regulation in Tgfbi

Transforming growth factor beta-induced gene (Tgfbi) is associated with corneal development and healing, adhesion and spreading of fibroblast and tumor suppressor activity. Mutations in Tgfbi have caused different kinds of cornea dystrophies. Recent studies have revealed epigenetic defects in Tgfbi, in association in several kinds of cancers. This chapter studies various epigenetic mechanisms controlling Tgfbi, and epigenetic therapy in treating deregulation of Tgfbi is anticipated.

5azadC induced demethylation of hypermethylated regions of Tgfbi in NIH/3T3 cells. Similar to those in Chapter 1, the regions were resistant to demethylation at 1 μM compared to 0.1 μM of 5azadC, but CpG island was demethylated by both concentrations. 5azadC induced increment of H3K9me3 and a reduced level of H3K9me2. Increased of H3K4 marks corresponded to gene upregulation.

In Dnmt knock out cells, DNA methylation of Tgfbi was severely depleted. A complete loss of methylation was observed in Dnmt3a(-/-)3b(-/-), and was accompanied by increased H3K9me2 and a drastic decrease of H3K9me3 in Tgfbi. In Dnmt1(-/-) cells, a moderate level of DNA methylation remained, H3K9me3 level was maintained and H3K9me2 was decreased. Together with 5azadC results, these suggested the role of H3K9me3 in DNA methylation maintenance.

Histone H3K9 methyltransferase G9a deficient cells had a reduced DNA methylation level in Tgfbi compared to wild type, and the DNA methylation level was further reduced following Dnmt1 knock down. In contrast, Suv39h deficient did not affect DNA methylation level. Taken together, DNA methylation maintenance in Tgfbi involves both Dnmts and G9a, and that 5azadC-induced demethylation resistance might involve complicated changes governed by these enzymes.

Discussion

Current studies provide evidence that 5azadC has different impact on DNA methylation between non-genic regions and genic regions. Non genic repetitive sequences were strongly demethylated by 5azadC, but genic regions were only demethylated at particular concentrations and were minimally affected by higher dosage.

5azadC does not only affect DNA methylation, but also alter histone modifications with unusual comination. Of this combination of histone modifications, H3K9me2 decreased followed by increase of H3K9me3 maybe responsible for resistance of genic regions to 5azadC-demethylating activity. Since changes of H3K9me2/H3K9me3 were not observed in G9a deficient cells, and DNA methylation was reduced in G9a deficient cells and was further reduced by Dnmt1 knock down, implying that G9a is involved in 5azadC resistance mechanisms.

エピジェネティクスは、遺伝子配列の変化無しに次世代細胞に伝達しうる遺伝子機能を研究する学問領域で、哺乳類を含む多細胞生物の発生の基礎になっている。エピジェネティクス系は、主にDNAやヒストン修飾により制御されており、その破綻はがんを含む慢性疾患の原因になっていることが明らかになりつつある。様々な慢性疾患は、遺伝子の機能に焦点を当てた研究が行われてきたが、さらに広範囲にわたる研究により、エピジェネティクス系の異常ががんや精神遅滞、発育異常などの病気を引き起こしうることが分かってきたのである。エピジェネティック異常の治療薬は、医療分野において大きな可能性をもたらすことを示している。

哺乳類(マウス、ヒト)では5種類のDNAメチル基転移酵素(Dnmt)の存在が報告されている。単独で酵素活性を持つのはDnmt1、Dnmt3aおよびDnmt3bである。5-aza-2'-deoxycytidine (5azadC)はDnmt1阻害剤で、がんの治療薬としても利用されはじめた。その背景には5azadCはゲノム全体のDNAメチル化状況に影響を与えると考えられていることにある。ところが、先に、各Dnmt欠損細胞の遺伝子領域と非ゲノム繰り返し領域のDNAメチル化状況を解析した実験から、遺伝子領域と非遺伝子領域とは各Dnmtの関与が異なっていることが判明している。そうすると、5azadCのDNAメチル化への影響も異なって不思議は無い。しかし、従来5azadCの効果は繰り返し領域を主体に研究されており、遺伝子領域と区別して解析した例は少ない。本論文は、5azadCのDNAメチル化に与える影響が、遺伝子領域と繰り返し配列を主体とする非遺伝子領域では異なるのか否かを調べたものである。

第1章では、NIH/3T3細胞を用いて6遺伝子領域(Oct-4, Sall3, Per1, Clu, Dpep1, Igf2r)と2非遺伝子領域(マイナーサテライト、内在性Cタイプウイルス)に対する5azadCの影響を調べている。様々な濃度(0.001~5μM)の5azadCでNIH/3T3細胞を72時間あるいは96時間培養した場合には、非遺伝子領域はいずれも濃度依存的に脱メチル化された。特に1と5μMの高濃度では強く脱メチル化されていた。したがって、従来の報告にあるように、5azadCは脱メチル化を促進することが確認された。ところが、遺伝子領域でのメチル化レベルは0.1μMの時のみ低下したが、濃度を増しても脱メチル化は亢進せず、むしろ非処置細胞と殆ど変わりないレベルに留まることが明らかになった。この遺伝子領域の5azadCへの抵抗性は、CpG配列が豊富な遺伝子領域および少ない遺伝子領域でも同じ傾向が見られた。このことから、遺伝子領域では反復配列と異なり5azadCに対して抵抗性を示すことが初めて明らかになった。

多くの場合、エピジェネティクス制御下にある遺伝子発現は5azadCとヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤で活性化される。そのことから、がん治療の目的でDNA脱メチル化阻害剤とHDAC阻害剤の組み合わせが提唱されている。上記のように、低濃度(0.1μM)の5azadCによっては遺伝子領域が部分的に脱メチル化される。その際、当該遺伝子は発現が誘導されることが観察された。ところが、5azadCによってヒストンH3のアセチル化は亢進せず、低下することが明らかになった。一方、ヒストンH3K4のメチル化が起こり遺伝子発現の亢進と矛盾しないことが明らかになった。さらに面白いことに、遺伝子発現抑制型のヒストンH3K9のメチル化亢進が見られた。

第2章ではTgfbi遺伝子領域に焦点を絞り、5azadCが与える影響が解析された。Tgfbi遺伝子は角膜の発生に不可欠な分泌タンパク質をコードし、CpG配列の豊富な、いわゆるCpGアイランドを有する。また、Tgfbiの変異はがんの発生を伴い、がん治療のエピジェネティクスターゲットとしての報告もある。第1章と同様に、NIH/3T3細胞において、5azadC濃度が0.1μMの時と比較して1μMの時にはこの領域での脱メチル化に対する抵抗性が見られた。また、5azadCによってH3K4メチル化の増加に伴い遺伝子発現が亢進しており、H3K9メチル化の増加が引き起こされた。

ヒストンH3K9メチル基転移酵素であるG9aの欠損細胞では、Tgfbi遺伝子領域のDNAメチル化レベルが減少しており、5azadCによる抵抗性も低下していた。一方、同じくヒストンH3K9メチル基転移酵素であるSuv39hの欠損細胞では、DNAメチル化レベルに影響を与えることは無かった。以上を考え合わせると、5azadCに誘導される脱メチル化抵抗性には、G9aによるヒストンH3K9のメチル化が関与することが示唆された。

以上、本論文では様々なゲノム領域を対象に研究し、5azadC処理は非遺伝子領域では容易に脱メチル化を誘導できるが、遺伝子領域では脱メチル化が起きにくいことを明らかにした。5azadCに対する抵抗性にはG9aの関与が示唆され、また、部分的な脱メチル化による遺伝子発現の増加にはH3K4メチル化が伴うことも明らかにした。これらの発見は遺伝子制御の基礎として重要であるばかりでなく、制がん剤としてのDNA脱メチル化剤開発にも重要な視点を提供している。よって、審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。