Abstract

Transforming growth factor-β(TGF-β) is a member of the TGF-β family, which has diverse activities including cell growth and differentiation. Aberration of TGF-β signaling has been believed to cause various diseases such as cancer and fibrosis. Thus, analysis of the regulatory mechanism of TGF-β signal transduction in detail is important to understand the process of many diseases related to aberrant TGF-β signaling. TGF-β signal is transduced through receptor kinases and their downstream effectors, Smad proteins. Activated Smad complex translocates into the nucleus to regulate transcription of target genes. TGF-β signaling is controlled by a variety of regulators that target either signaling receptors or activated Smad complexes. Among negative regulators, Smad7, a negative feedback regulator, antagonizes TGF-β signaling mainly through targeting the signaling receptors, whereas SnoN and c-Ski repress signaling at the transcriptional level through inactivation of Smad complexes.

Koinuma et al previously found that Arkadia is a positive regulator of TGF-β signaling which induces ubiquitin-dependent degradation of Smad7 through its C-terminal RING domain. I report here that Arkadia induces degradation of SnoN and c-Ski in addition to Smad7.

Arkadia interacts with SnoN and c-Ski and colocalizes with them in the nucleus. Arkadia mediates ubiquitylation of SnoN and c-Ski and accelerates their turnover through its RING domain. Consistently, levels of expression of SnoN protein are higher in Arkadia(-/-) ES cells than in wild-type ES cells, and c-Ski protein accumulates in Arkadia-knocked down cell lines. In addition, Arkadia interacts with SnoN and c-Ski in their free forms as well as in the forms bound to Smad proteins, suggesting that Arkadia may constitutively down-regulate levels of expression of SnoN and c-Ski. Arkadia thus appears to effectively enhance TGF-β signaling through simultaneous down-regulation of two distinct types of negative regulators, Smad7 and SnoN/c-Ski, and may play an important role in determining the intensity of TGF-β signaling in target cells (Fig. 1).

Increased expression of SnoN and c-Ski has been reported in several tumors, but expression of Arkadia in tumors has not been examined yet. I also report that Arkadia is expressed in various tumor cell lines, whereas expression levels of SnoN and c-Ski are variable. In addition, Arkadia may not be functional in some tumor cell lines, since c-Ski protein does not accumulate in some Arkadia-silenced tumor cells. Elucidating the roles of Arkadia in tumor cells will be an important task in the near future.

Fig. 1 A model of enhancement of TGF-β signaling by Arkadia

本研究は、癌を初めとする様々な疾患の進行に関わるTGF-βシグナルの伝達の調節機構の詳細な解明の重要性から、特にTGF-βシグナル増強因子であるユビキチンリガーゼArkadiaがどのようにしてシグナルを調節しているかを明らかにするため、生化学的・分子生物学的手法を用いて作用機構を検討したものであり、以下の結果を得ている。

1、TGF-β応答性のレポーターを用いたレポーターアッセイにおいて、Arkadiaは、その分解基質であるSmad7をノックダウンした状態でもレポーター活性を上昇させた。このことから、ArkadiaにはSmad7以外の分解基質がある可能性が考えられた。

2、Arkadiaは、Smad7とは異なる作用点でTGF-βシグナルを抑制するSnoNおよびc-Skiと結合し、これらをユビキチン化し、プロテアソーム依存的な分解に導いて、代謝回転を速めた。

3、ArkadiaをノックアウトしたES細胞では、SnoNの発現量がタンパク質レベルで高くなっていた。また、Arkadiaをノックダウンした細胞ではc-Skiタンパク質の蓄積が認められた。これらのことから、ArkadiaがSnoNやc-Skiをタンパク質レベルで制御していることが明らかとなった。

4、ArkadiaおよびSnoN/c-Skiをいくつかの断片に分けて結合実験を行った結果、ArkadiaのC末端領域が基質との結合に重要であることが、また、ArkadiaはSnoN/c-Ski上の中央領域すなわちSmad4のSnoN/c-Ski上の結合部位を含む領域に結合することが示された。

5、SnoNやc-SkiがSmad2/4複合体とArkadiaに同時に結合し得るか調べるため、3 x CAGA配列をプローブとしたDNA-affinity precipitation (DNAP)法を用いてSmad4を沈降させ、共沈するSmad2、SnoNまたはc-Ski、およびArkadiaの検出を試みた。その結果、Arkadiaは用量依存的に、Smad2、Smad4、SnoN/c-Skiを含む複合体に共沈した。また、この共沈はSnoN/c-Ski依存的であった。これらのことから、Arkadiaは、遊離しているSnoN/c-Skiとも、複合体中のSnoN/c-Skiとも結合することが示唆された。

6、TGF-β応答性のレポーターを用いたレポーターアッセイにおいて、Arkadiaは、その分解基質であるSmad7、c-Ski、SnoN全てを同時にノックダウンするとレポーター活性を上昇させなくなった。このことから、これら3つがArkadiaの主要な基質であると考えられた。

7、20種の癌細胞株におけるArkadia、c-Ski、SnoNの発現量をmRNAおよびタンパク質のレベルで調べた。ArkadiaはmRNAレベルでもタンパク質レベルでも様々な癌細胞株で広範に発現していたのに対し、c-SkiとSnoNはmRNAもタンパク質も細胞株間でその発現量に大きな違いが認められた。また、OCUM-2MLNやMKN45を含むいくつかの細胞株では、c-SkiやSnoNの発現レベルがmRNA-タンパク質間で相関しなかった。

8、用いた癌細胞株においてArkadiaが機能しているかどうか、Arkadiaのノックダウンとそれに伴うc-Skiタンパク質の蓄積を指標に調べたところ、HeLa、MDA-MB-231、PC-3u、U373MG、MKN28/74の各細胞ではArkadiaのノックダウンによるc-Skiタンパク質の蓄積が認められたのに対し、OCUM-2MLN、MKN45ではArkadiaをノックダウンしてもc-Skiタンパク質の蓄積は観察されなかった。これらのことから、OCUM-2MLNやMKN45においてはArkadiaがc-Skiに対して機能していない可能性が考えられた。

以上、本論文は、ArkadiaがSmad7およびSnoN/c-Skiという作用点の異なる2種のTGF-βシグナル抑制因子をどちらも分解に導くことでより効果的にシグナルを増強することを明らかにし、また、癌におけるArkadiaの役割の解明の重要性を示した。本研究は、TGF-βシグナルの許容レベルを決定する因子の発見として重要であり、また、癌を含め、TGF-βシグナルやc-Ski/SnoNによって引き起こされる病理的・生理的現象のメカニズムの解明に更なる糸口を与えるものと考えられ、学位の授与に値するものと思われる。