背景

血管内皮細胞増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor : VEGF/VEGF-A)とその受容体(VEGFR-1、VEGFR-2)システムは、正常な血管発生や血管新生だけでなく、がんなどを含む病的血管新生においても非常に重要な役割を担っている。VEGFR-1及びVEGFR-2は主に血管内皮細胞に発現しているが、VEGFR-1はほかにも単球・マクロファージ系細胞において発現が確認されており、細胞の遊走などに関与しているとの報告がある。

腫瘍はその異常な増殖を維持するために、近隣にある既存の血管から新たな血管新生を誘導し、栄養素や酸素の供給を行なう必要がある。腫瘍からは様々な血管新生誘導因子が分泌され、その中でもVEGFは主軸を担っていると考えられている。このように、腫瘍血管と腫瘍増殖は密接な関係にあるため、腫瘍血管新生を阻害し、腫瘍抑制効果を期待する「抗血管新生療法」が1970年代に提唱された。それ以降、VEGFをはじめとする血管新生誘導因子が次々と発見され、腫瘍増殖とVEGF/VEGFRに関する研究は盛んに行なわれている。現在までに、原発巣が転移する前にVEGFR-1陽性細胞がそれを支持するような働きをするという報告や、VEGFR-1に対する特異的なリガンドである胎盤由来成長因子(Placenta Growth Factor : PlGF)を中和抗体で阻害することにより、有意な腫瘍増殖抑制効果が得られるという報告などがある。

本研究で私は、VEGFR-1シグナルががんの増殖促進にどのように関与するかを調べた。VEGFR-1シグナルを解析するにあたり、VEGFR-1のチロシンキナーゼより下流を欠損しているマウス(VEGFR-1 Tyrosine Kinase-deficient mouse : VEGFR-1 TK(-/-)マウス)を使用した。VEGFR-1 TK(-/-)マウスは、見かけ上正常な発達をするがVEGFR-1のシグナルのみを欠損しているため、野生型マウスと比較実験を行なうことでVEGFR-1のシグナル解析において非常に有用なモデルとなると考えられる。

結果

本研究では、まず野生型マウス及びVEGFR-1 TK(-/-)マウスに対して腫瘍移植実験を行ない、その増殖曲線を作成してVEGFR-1シグナルが腫瘍増殖に寄与するかどうかを検討した。使用した腫瘍細胞はC57BL/6Jマウス子宮体部由来子宮がん細胞HSML及び同系マウス肺由来肺がん細胞LLC、同系マウス皮膚由来悪性黒色腫B-16を使用した。腫瘍移植実験の結果より、これら3種類の腫瘍のうち、VEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植したHSML腫瘍及びB-16腫瘍の2種類の腫瘍増殖が、野生型マウスに移植したものと比較して有意に抑制されていた。一方、LLC腫瘍の増殖には有意な差は認められなかった。

この腫瘍増殖の抑制効果が、VEGFR-1シグナルを介した腫瘍血管新生に起因するものかどうかを検討するために、抗CD31モノクローナル抗体を用いて、免疫組織化学的染色を行なった。その結果、HSML腫瘍及びLLC腫瘍における腫瘍内への血管新生は、野生型マウスに移植した腫瘍と比較して、VEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍において、有意に抑制されていた。驚くべきことに、腫瘍内への血管新生は抑制されていたにもかかわらず、腫瘍周辺部位における血管新生は、野生型マウスに移植した腫瘍とVEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍で、大きな差は認められなかった。また、腫瘍内の新生血管を定量したところ、HSML腫瘍内における血管内皮細胞は、VEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍内において野生型マウスに移植した腫瘍内に比べ、約45%にまで減少していた。

一方、VEGFR-1を発現している細胞として、単球・マクロファージ系細胞が挙げられる。これらにおけるVEGFR-1シグナルが、腫瘍増殖に関与しているかを検討するために、活性化されたマクロファージを認識する抗F4/80モノクローナル抗体を用いて、免疫組織化学的染色を行なった。その結果、野生型マウスに移植した腫瘍内と比較して、VEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍内では、F4/80陽性マクロファージ系細胞の浸潤が、著しく抑制されていた。また、注目すべきことに腫瘍周辺部位へのF4/80陽性マクロファージ系細胞の遊走は、野生型マウスとVEGFR-1 TK(-/-)マウスのもので有意な差は認められなかった。浸潤してきたF4/80陽性細胞を定量したところ、VEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍内部へ浸潤してきた細胞は、野生型マウスの腫瘍内と比較して約15%にまで減少していた。

LLC腫瘍では、VEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍内部において、腫瘍血管新生及びF4/80陽性マクロファージ系細胞の浸潤が抑制されていたにもかかわらず、HSML腫瘍のものと比較して、いずれも野生型マウスに移植したものとの差は小さいものであった。これが腫瘍細胞から分泌される様々な増殖因子やケモカインの違いによるものかを検討するため、培養した腫瘍細胞からmRNAを抽出し、リアルタイムPCR法によってmRNAレベルでの発現検討を行なった。その結果、HSML及びB-16と比べ、LLCにおいてはFGF-2の発現が約150倍にも亢進していた。

次に、VEGFR-1を発現している、血管内皮細胞及びマクロファージ系細胞において、どちらのVEGFR-1シグナルがどの程度寄与しているかを検討するために、骨髄移植実験を行なった。骨髄移植を受けるマウスは野生型とし、骨髄提供をするマウスを野生型(Wt / Wt)とVEGFR-1 TK(-/-)型 (Wt / VEGFR-1 TK(-/-))にした。HSML腫瘍を移植して増殖曲線を作成した結果、Wt / VEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍の増殖は、Wt / Wtマウスに移植したものと比較して、有意に抑制されていた。また、腫瘍内への血管新生及びマクロファージ系細胞の浸潤を検討した結果、骨髄をVEGFR-1 TK (-/-)型に置換したマウスにおいて有意に減少していた。以上のことから、VEGFR-1は腫瘍増殖に関与しており、腫瘍周囲ではなく腫瘍内へ血管新生、細胞浸潤に作用していることが明らかとなった。さらに骨髄由来細胞であり、且つVEGFR-1を発現している細胞すなわちマクロファージ系細胞におけるVEGFR-1シグナルが、腫瘍血管新生を促進し、結果として腫瘍増殖へと繋がることに大きく関与していることが示唆された。

考察

VEGF-Aによる血管新生及び腫瘍血管新生には、VEGFR-2のシグナルによる血管内皮細胞の増殖が重要であると考えられてきた。しかし本研究において私は、VEGFR-1 TK(-/-)マウスにおける腫瘍移植実験によって、VEGFR-1シグナルが腫瘍増殖に深く関与していることを見出した。さらに詳細な実験の結果から、腫瘍周辺部位においては野生型マウスとVEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍で有意な差が認められなかったこと、VEGFR-1 TK(-/-)マウスに移植した腫瘍では、腫瘍内への腫瘍血管新生及びマクロファージ系細胞の浸潤が著しく抑制されることも明らかにした。すなわち、腫瘍周辺部位への血管内皮細胞及びマクロファージ系細胞の遊走はVEGFR-1シグナル非依存的であり、腫瘍内組織への浸潤にはVEGFR-1シグナル依存的なシグナルが働いていることが示唆された(図)。腫瘍内へ浸潤したマクロファージ系細胞は、免疫担当細胞としての機能だけでなく、腫瘍関連マクロファージ(Tumor-associated macrophage : TAM)として自ら血管新生誘導因子を分泌し、腫瘍血管新生を亢進するという腫瘍増殖促進作用が報告されている。骨髄移植の実験結果から、骨髄由来細胞はVEGFR-1を介して腫瘍内に浸潤し、それが腫瘍血管新生及び腫瘍増殖にも寄与することが示唆された。

以上のことから、VEGFR-1のチロシンキナーゼを標的としたがん治療は、骨髄由来細胞の浸潤を抑え、腫瘍血管を抑制することが示唆されるので、正常血管における副作用を軽減し、抗腫瘍効果が期待できるものと考えられる。

図:腫瘍増殖に関与するVEGFR-1チロシンキナーゼの有無の概略図

本研究は固形腫瘍の増殖と密接にかかわる腫瘍血管新生における、血管内皮増殖因子受容体1(VEGFR-1)の働きを検討するため、VEGFR-1のチロシンキナーゼより下流を欠損しているVEGFR-1チロシンキナーゼ欠損(VEGFR-1 TK (-/-))マウスを用いて、野生型マウスとの腫瘍移植実験による比較検討を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1.3種類の腫瘍細胞(HSML及びLLC、B16)をそれぞれ野生型マウスとVEGFR-1 TK (-/-)マウスに皮下移植し、このうち2種類の腫瘍細胞(HSML及びB16)において腫瘍の有意な増殖抑制が認められたため、異所性同種間における腫瘍細胞皮下移植実験の系においては、腫瘍増殖にVEGFR-1のチロシンキナーゼが関与することが示された。

2.VEGFR-1を発現していると報告されている血管内皮細胞及び単球・マクロファージ系細胞の検討を、上記の系を用いて行った。その結果、腫瘍周辺部位における血管内皮細胞の遊走やマクロファージ系細胞の遊走は野生型マウスに移植した腫瘍とVEGFR-1 TK (-/-)マウスに移植した腫瘍とで変化は認められなかった。しかし、腫瘍内への血管新生及びマクロファージ系細胞の浸潤を比較検討したところ、VEGFR-1 TK (-/-)マウスに移植した腫瘍では、野生型マウスに移植した腫瘍と比較して顕著に抑制されていることを見出した。このことから、移植された固形腫瘍の内部への腫瘍血管新生及びマクロファージ系細胞の浸潤には、VEGFR-1が関与し、周辺部位まで集積するにはVEGFR-1をほとんど介さない系が存在することが示された。

3.骨髄由来細胞であるマクロファージ系細胞におけるVEGFR-1が、固形腫瘍の増殖に関与するかを検討するため、骨髄提供マウスを野生型及びVEGFR-1 TK (-/-)型に分けて骨髄移植実験を行なったところ、移植したHSML腫瘍の増殖がVEGFR-1 TK (-/-)型の骨髄を移植したマウスにおいて抑制された。また、このときの腫瘍血管新生及びマクロファージ系細胞の浸潤も腫瘍内で有意に減少していたことを見出した。このことは、VEGFR-1を介して、骨髄由来細胞が腫瘍内へ浸潤することが腫瘍血管新生だけでなく、腫瘍増殖にも関与することを示す結果であると示唆される。

以上、本論文はVEGFR-1 TK (-/-)マウスを用いた系より、固形腫瘍の増殖や腫瘍血管新生におけるVEGFR-1の機能解析を行い、骨髄由来細胞であるマクロファージ系細胞がVEGFR-1のチロシンキナーゼを介して浸潤すること、それが腫瘍血管新生や腫瘍増殖に寄与することを明らかにした。腫瘍の微小環境とVEGFR-1の関係性は近年注目されている分野であり、その研究の一環として有意な研究報告であると考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。