[背景]

線維芽細胞増殖因子 (fibroblast growth factor : FGF)23は、FGFファミリーの一員として同定された蛋白である。FGF23は常染色体優性低リン血症性くる病/骨軟化症 (autosomal dominant hypophosphatemic rickets/osteomalacia : ADHR)の原因遺伝子として同定され、腫瘍性くる病/骨軟化症 (tumor-induced rickets/osteomalacia : TIO)の低リン血症惹起液性因子であることも報告された。FGF23は腎近位尿細管での2a、2c型ナトリウム-リン共輸送体の発現抑制と、25-水酸化ビタミンD-1α-水酸化酵素の発現低下を介し、血中リン濃度を低下させる。

FGF23ノックアウトマウスが著明な高リン血症を起こすことや、正常健常人において高リン負荷や低リン食で、FGF23血中濃度がそれぞれ上昇、低下することから、FGF23は血中リン濃度の生理的調節因子と考えられる。FGF23は、Klothoと1型FGF受容体の複合体に作用し、ERKリン酸化やearly growth response 1 (Egr-1)遺伝子発現の誘導などを惹起する。

一部のFGF23蛋白は、RXXRを認識するスブチリシン様プロテアーゼにより(179)Argと(180)Serの間でプロセッシングを受け、不活性なフラグメントに分解される(図1)。

- リン代謝異常とFGF23 -

ADHRやTIOに加え、X染色体優性低リン血症性くる病/骨軟化症 (X-linked hypophosphatemic rickets/osteomalacia : XLH)や常染色体劣性低リン血症性くる病/骨軟化症 (autosomal recessive hypophosphatemic rickets/osteomalacia : ARHR)も過剰なFGF23活性により惹起されることが報告された。逆に、尿細管でのリン再吸収亢進による高リン血症と、高1,25-水酸化ビタミンD血症、異所性石灰化を特徴とし、ADHRやARHR、XLH、TIOと鏡像をなす疾患として、家族性高リン血症性腫瘍状石灰沈着症 (familial hyperphosphatemic tumoral calcinosis : FTC)が知られている。FTCの原因遺伝子としてはFGF23遺伝子と、UDP-N-acetyl-α-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase3 (ppGaNTase-T3)をコードするUDP-N-acetyl-α-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase3 (GALNT3)遺伝子、およびKlotho遺伝子が報告されている。このうちppGaNTase-T3蛋白は、ムチン型O型糖鎖付加を媒介する酵素である。GALNT3遺伝子変異によるFTCでは、FGF23蛋白のプロセッシングが亢進し、生理活性のある全長FGF23蛋白が減少することが明らかにされている。したがって、FGF23蛋白へのO型糖鎖付加は、FGF23蛋白活性に重要な意義を持っているものと考えられる。

- FGF23蛋白への糖鎖付加 -

野生型FGF23蛋白は、培養液中では生理活性のある全長FGF23蛋白、およびプロセッシングを受けたフラグメントとして存在している。C端抗体を用いたウエスタンブロットでは、全長FGF23蛋白は32kDa近辺に、C端フラグメントは16kDa近辺に検出される(図2)。プロセッシング部位近傍の(176)Arg, (179)ArgをGlnへ変異させたFGF23蛋白(以下RQ蛋白と記載)は、プロセッシングを受けず、培養液中では、糖鎖の数にしたがって3本のバンドして検出される。このRQ蛋白の3本のバンドをそれぞれ質量分析したところ、FGF23蛋白は最初に199~228番の間、次に162~175番の間、最後に176~187番の間のSerまたはThrにO型糖鎖付加を受けると考えられた。

[目的]

FGF23の糖鎖付加の意義について明らかするために、以下の検討を行った。

1.FGF23蛋白への3か所の糖鎖付加部位の決定

2.糖鎖付加異常がFGF23蛋白のプロセッシングに及ぼす影響

3.糖鎖付加異常がFGF23蛋白の活性に及ぼす影響

[方法]

- 糖鎖付加部位を決定 -

RQ蛋白において、糖鎖付加の可能性がある10か所のSerまたはThrをAlaに変異させた蛋白を、ヒト骨芽細胞様細胞株HOS TE-85細胞に発現させて、培養上清中のFGF23蛋白を、(180)Serから(196)Argの間の配列を認識するC端抗体(図3)を用いてウエスタンブロットで解析した。

- 糖鎖付加障害による蛋白発現の変化 -

RQ蛋白にT171A、T178A、T200Aを2~3種類導入し、ウエスタンブロットで解析した。

-糖鎖付加障害によるプロセッシングの変化 -

血清中では、一部の全長FGF23蛋白は、セリンプロテアーゼの一種であるthrombinにより(196)Argと(197)Alaの間で切断され、(25)Tyr~(196)Argと(197)Ala~(251)Ileへ分解される(図3)。Protease inhibitor cocktail(PIC)は、セリンプロテアーゼなどを阻害するプロテアーゼインヒビターである。

野生型FGF23蛋白にT171A, T178A, T200Aを導入し、ウエスタンブロットで解析した。更に、培養上清にはPICを添加して同様に検討した。

- 糖鎖付加障害による蛋白活性の変化 -

野生型FGF23蛋白、およびT200A変異蛋白をHOS TE-85細胞の培養上清から採取した。Thrombinの影響を避けるために無血清培地を使用し、PICを培養上清に添加した。Klotho蛋白を発現させたHEK293細胞にFGF23蛋白を作用させ、egr-1レポーターアッセイでFGF23蛋白活性を測定した。

[結果]

- FGF23蛋白の糖鎖付加部位 -

RQ蛋白にT171A, T178A, T200A変異を導入したところ、32kDa近辺の3本のバンドのうち、分子量が最も大きく、3つの糖鎖を持つと考えられるバンドが消失した(図4)。RQ蛋白にT171A, T178A, T200A変異を2~3種類導入したところ、バンドはさらに消失した(図5)。

- 野生型FGF23蛋白への変異導入 -

野生型FGF23蛋白にT171A, T178A変異を導入すると、32kDa近辺の蛋白はほぼすべて消失した(図6, 7)。一方、T200Aでは、PIC添加時は32kDa近辺(図7)、PIC無添加時は22kDa近辺にバンドを認めた(図6)。

- T200A変異蛋白の機能解析 -

野生型FGF23蛋白にT200A変異を導入しても、FGF23蛋白活性は変化しなかった。

[考察]

RQ蛋白にT171A, T178A, T200A変異を導入した結果から、FGF23蛋白への糖鎖付加は、最初に(200)Thr、次に(171)Thr、最後に(178)Thrに生じると考えられた。

図4、5の結果から糖鎖付加のルールを検討した(図8)。RQ(T171A, T178A)の結果から、(200)Thrの糖化は約100%生じ、RQ(T178A, T200A)の結果から、(171)Thrの糖化は約半分で生じると考えられた。RQ(T171A, T200A)の結果から、(178)Thrは単独では糖鎖付加を受けず、RQ(200A)の結果から、(178)Thrの糖化には(171)Thrの糖化が必須であると判明した。

野生型FGF23蛋白にT171AまたはT178A変異を導入すると、プロセッシング亢進を認めた(図6、7)。RQ蛋白の結果から、T171Aでは、(171)Thrだけでなく(178)Thrへの糖化も障害されていると考えられた。したがって、プロセッシング阻害には178Thrの糖化が必須と考えられた。一方、T200A変異では、プロセッシング亢進を認めなかった(図7)。

また、RQ蛋白の3本のバンドの比率を検討したところ、一番上のバンドは約46%、中央のバンドは約9%、一番下のバンドは約45%であった。

上記の結果から、最初に(200)Thrがほぼ100%糖化され、次に(171)Thrが約55%糖化され、そのうち約84%が(178)Thrにも糖化されることが明らかとなった(図9)。そして、(178)Thrに糖鎖がない蛋白はプロセッシングを受け、不活性なフラグメントとなることが示された。

野生型FGF23蛋白にT200A変異を導入したところ、PIC添加時は32kDa近辺(図7)、PIC無添加時は22kDa近辺に蛋白が検出された(図6)。過去の検討によると、thrombinによる分解産物である(25)Thy~(196)Argは約22kDaである。したがって、T200A変異は、thrombinによるFGF23蛋白分解を促進することが示唆された。しかしin vivoの血漿中では(196)Argと(197)Alaの間で分解された蛋白を認めない。したがって、その生理的意義は不明である。

また、(200)Thrの糖化はFGF23蛋白の活性に関与しなかった。

[結論]

FGF23蛋白は(171)Thr, (178)Thr, (200)Thrに糖鎖付加を受けることが明らかとなった。(171)Thrの糖化は(178)Thrの糖化に必須であり、(178)Thrの糖化はプロセッシングの阻害に必須であった。(200)Thrの糖化は、プロセッシングや蛋白の活性に影響しなかった。(200)Thrの糖化は、in vitroの血清中ではthrombinによる全長FGF23蛋白分解を抑制するが、その生理的意義は不明である。

図1: FGF23蛋白のプロセッシング

RXXRを認識するスブチリシン様プロテアーゼにより(179)Argと(200)Serの間でプロセッシングを受け、不活性なフラグメントとなる。

図2: FGF23蛋白へのO型糖鎖付加

培養液中のFGF23蛋白を、FGF23蛋白C端側に対する抗体を用いたウエスタンブロットで検討した。野生型蛋白では、全長蛋白が32kDa近辺に、C端フラグメントが16kDa近辺に検出される。RQ蛋白は、糖鎖の数にしたがって3本のバンドとして検出される。FGF23蛋白は最初に199~228番の間、次に162~175番の間、最後に176~187番の間のSerまたはThrにO型糖鎖付加を受けると考えられた。

図3: thrombinによる全長FGF23蛋白の切断

血清中では、一部の全長FGF23蛋白は、thrombinにより(196)Argと(197)Alaの間で切断を受ける。今回のウエスタンブロットで使用したC端抗体は、(180)Serから(196)Argの間の配列を認識している。

図4 FGF23蛋白の糖鎖付加部位

T171A, T178A, T200Aでは、最も分子量が大きく、3つの糖鎖を有すると考えられるバンドが消失した。

図5: FGF23蛋白への糖鎖付加部位

RQ蛋白にT171A, T178A, T200A変異を2~3種類導入したところ、バンドはさらに消失した。

図6 野生型FGF23蛋白への変異導入(PIC無添加)

野生型FGF23蛋白にT171A、T178A変異を導入すると、全長FGF23蛋白は消失した。T200A変異では、22kDa近辺のバンドを認めた。

図7 野生型FGF23蛋白への変異導入(PIC添加)

野生型FGF23蛋白にT171A、T178A変異を導入すると、全長FGF23蛋白は消失した。T200A変異では、32kDa近辺のバンドを認めた。

図8 T171A, T178A, T200A変異蛋白のバンドパターンのまとめ

RQ(T171A, T178A)→(200)Thrへの糖鎖付加はほぼ100%起こる。

RQ(T178A, T200A)→(171)Thrへの糖鎖付加は約半分で起こる。

RQ(T17A, T200A)→(178)Thrは単独では糖鎖付加がおこらない。

RQ(200A)→(171)Thrが糖化されると、そのうちの多くが(178)Thrも糖化される。

図9 FGF23蛋白の糖鎖付加の形式

最初に200Thrが糖化される。次に約55%が171Thrに糖化を受ける。更に約84%が178Thrにも糖化を受ける。178Thrに糖化を受けた蛋白はプロセッシング抵抗性だが、178Thrに糖化を受けなかった蛋白は不活性なフラグメントとなる。

本研究はFGF23蛋白の活性維持に重要な役割を演じていると考えられるムチン型O型糖鎖付加について明らかにするために、ヒト骨芽細胞様細胞株HOS-TE85細胞に変異FGF23蛋白を導入する系を用いて、ウエスタンブロットで解析を行ったものであり、下記の結果を得ている。

1. (176)Arg、(179)ArgをGlnへ変異させたFGF23蛋白(RQ蛋白)を発現するベクターを作成した。RQ蛋白において162~228番目の間に存在する10ヵ所のSerあるいはThrをそれぞれAlaに変異させた蛋白を発現するベクターを作成し、HOS-TE85細胞に導入した。培養上清中のFGF23蛋白を、FGF23蛋白のC端側に対する抗体を用いたウエスタンブロットで解析したところ、糖鎖付加部位は(171)Thr, (178)Thr, (200)Thrであることが示された。

2. RQ蛋白において、T171A, T178A, T200A変異の2~3種類を導入した蛋白を発現するベクターを作成し、同様にウエスタンブロットで解析した。その結果、(200)Thrへの糖鎖付加は約100%生じること、(171)Thrへの糖鎖付加は約55%生じること、(178)Thrへの糖鎖付加には(171)Thrの糖鎖が必須であること、(171)Thrが糖化された蛋白はそのうちの約84%が(178)Thrにも糖化されることが示された。

3. 野生型FGF23蛋白においてT171A, T178A, T200A変異を導入した蛋白を発現するベクターを作成した。セリンプロテアーゼを阻害するprotease inhibitor cocktailを添加した条件下で解析したところ、スブチリシン様プロテアーゼによるプロセッシングの阻害には(178)Thrへの糖鎖付加が必須であることが示された。一方、(200)ThrへのO型糖鎖付加は、スブチリシン様プロテアーゼによるFGF23蛋白プロセッシングには影響しなかった。

4. Alpha-Klothoの発現ベクターを導入したHEK293細胞を用いて、egr-1レポーターアッセイを行ったところ、(200)ThrへのO型糖鎖付加は、蛋白活性に関与していないことが示された。

5. Protease inhibitor cocktailを添加しない条件下でのウエスタンブロット解析や全長FGF23アッセイの結果から、(200)Thrへの糖鎖付加はthrombinによるFGF23切断を阻害していることが示唆された。

以上、本論文はヒト骨芽細胞様細胞株HOS-TE85細胞に発現させた変異FGF23蛋白の解析から、FGF23蛋白へのO型糖鎖付加の正確な部位や、それぞれの糖鎖付加の意義について検討した。本研究はFGF23蛋白の翻訳後修飾について解明したものであり、学位の授与に値するものと考えられる。