[序論]

同種異系骨髄移植(allogeneic bone marrow transplantation; alloBMT)は白血病や遺伝性疾患の有効な治療法であるが、合併症として移植片対宿主病(graft-versus-host disease; GVHD)が問題となっている。GVHDは急性GVHD(acute GVHD; aGVHD)と移植後100日以降に発症する慢性GVHD(chronic GVHD; cGVHD)に分けられる。GVHDはドナー骨髄移植片中の同種異系反応性T細胞の活性化がその主たる原因となり、aGVHDではドナー由来CD8+T細胞とレシピエント残存抗原提示細胞(antigen-presenting cells; APCs)が、cGVHDではドナー由来CD4+T細胞とドナー由来APCs及びレシピエント残存APCsが発症に関与していることが報告されている。また、cGVHDではaGVHDと比較して有効な治療の開発が遅れているのが現状である。

樹状突起を有する白血球である樹状細胞(dendritic cells; DCs)は、分化系列と成熟段階の異なる多様なサブセットから構成され、生体においてリンパ組織や末梢組織に広く存在している。未熟樹状細胞(immature DCs; iDCs)は侵襲してきた病原体をパターン認識受容体(pattern-recognition receptors; PRRs)を介して細胞内に取り込み抗原処理を行う。さらに、病原体侵襲により惹起された炎症環境下で主要組織適合抗原複合体(major histocompatibility complex; MHC)分子と共刺激分子・共刺激分子リガンドの発現増加を伴って成熟樹状細胞(mature DCs; mDCs)となり、二次リンパ組織に移行して抗原をナイーブT細胞に提示し、エフェクターT細胞を分化誘導する。このように、DCsは最も強力なAPCsとして自然免疫系と獲得免疫系を繋ぐ重要な役割を担っている。

免疫寛容は免疫学的恒常性の維持に必須であり、中枢性免疫寛容(central tolerance)と末梢性免疫寛容(peripheral tolerance)に分けられる。中枢性免疫寛容には胸腺での負の選択による自己反応性T細胞のクローン除去(clonal deletion)が関与する。一方、末梢性免疫寛容にはクローン除去と不活性化(アナジー;anergy)とともに、胸腺由来CD4+CD25+Foxp3+内在性制御性T(naturally occurring regulatory T; nTR)細胞や環境条件によってCD4+ナイーブT細胞から誘導されるインターロイキン-10(interleukin-10; IL-10)産生1型制御性T(T regulatory type 1; Tr1)細胞等を介した能動的抑制が関わっている。これまでに、in vivoの定常状態(非炎症環境下)においてiDCsが末梢性免疫寛容の誘導に関与することが示唆されている。さらに、様々な免疫抑制分子で処理したiDCは免疫寛容誘導性樹状細胞(tolerogenic DCs)として、アナジーT細胞やIL-10産生Tr1細胞の誘導、CD4+CD25+Foxp3+nTR細胞の増幅を行うことが報告されている。一方、佐藤らはヒトとマウスにおいて従来のtolerogenic DCsよりも強力なT細胞制御能(アナジーT細胞・Tr1細胞・CD4+CD25+TR細胞誘導能等)を示す制御性樹状細胞(regulatory DCs; DC(regs))を報告している。

[目的]

本研究では、alloBMT後の治療困難な合併症として問題となっているcGVHDに対して、ヒトcGVHDと類似の臨床症状を呈するマウスMHC一致・マイナー組織適合抗原(minor histocompatibility antigen; miHAg)不一致allo BMTでのcGVHDモデルを用いてDC(regs)による新規免疫細胞療法についての検討を行った。

[方法]

全身放射線照射(total body irradiation; TBI)を行ったBALB/cマウスに対して、MHC一致(H-2d)・miHAg不一致のB10.D2マウスより得られたT細胞除去骨髄細胞とCD4+CD25-T細胞を用いてalloBMTを行った(未処置群)。実験群では移植後に免疫抑制剤であるラパマイシン(rapamycin; RAPA)あるいはレシピエントタイプmDCsまたはDC(regs)を投与した。移植後、皮膚cGVHDとして脱毛病変面積に基づくモニタリングを行い、発症率及び重症度を計測した (図1A-D)。次に、DC(regs)のcGVHD制御効果の作用機序を明らかにするために、移植レシピエントマウスよりドナー由来CD4+T細胞を分離して免疫学的解析を行った。また、移植レシピエントマウスにおけるドナー由来CD4+CD25+Foxp3+TR細胞の誘導についてフローサイトメトリー法にて検討した。さらに、DC(regs)のcGVHD制御効果におけるCD4+CD25+Foxp3+TR細胞の関与を明らかにするために、抗CD25抗体を用いたin vivo阻害実験を行った。 最後に、レシピエントタイプDC(regs)によるドナー由来同種異系反応性CD4+CD25+Foxp3+TR細胞誘導機構の解明を目的として、卵白アルブミン(ovalbumin; OVA)特異的T細胞受容体(KJ1-26 clonotype)を有し、かつCD4+CD25+Foxp3+nTR細胞を欠損するRag2(-/-)DO11.10 BALB/cトランスジェニックマウスのT細胞を用いて移入実験を行った。

[結果]

未処置群ではほぼ全てのレシピエントマウスで移植後45日目までに皮膚cGVHDの発症が認められたが、レシピエントタイプmDCs投与群では皮膚cGVHDの増悪が認められた。一方、RAPA投与群では皮膚cGVHDに対して殆ど防御効果が認められなかったが、レシピエントタイプDC(regs)投与群では皮膚cGVHDの発症率及び重症度に対する著しい防御効果が認められ、移植後120日を超える長期間においても症状が殆ど観察されなかった(図2A,B)。

未処置群より得られたドナー由来CD4+T細胞と比較すると、レシピエントタイプmDCs投与群より得られたドナー由来CD4+T細胞は同種異系抗原刺激に対して高反応性を示したが、レシピエントタイプDC(regs)投与群より得られたドナー由来CD4+T細胞は著しい低反応性を示した(図は論文中に掲載)。未処置群及びレシピエントタイプmDCs投与群より得られたドナー由来CD4+T細胞ではCD4+CD25+ Foxp3-エフェクターT細胞数の増加が認められたのに対して、レシピエントタイプDC(regs)投与群より得られたドナー由来CD4+T細胞ではCD4+CD25+Foxp3+TR細胞数の顕著な増加が認められた(図3A,B)。

また、レシピエントタイプDC(regs)投与群への抗CD25抗体投与によるCD4+CD25+T細胞の除去では、レシピエントタイプDC(regs)の皮膚cGVHDに対する防御効果が著しく阻害された(図4A,B)。

さらに、Rag2(-/-)DO11.10 BALB/cトランスジェニックマウスのT細胞を用いた移入実験の結果、BALB/cマウスへのRag2(-/-)KJ1-26+CD25-Foxp3-T細胞とOVAペプチドパルスDC(regs)の共移入ではRag2(-/-)KJ1-26+CD25+Foxp3+TR細胞が著しく誘導された。また、誘導されたRag2(-/-)KJ1-26+CD25+Foxp3+TR細胞は抗原刺激に対してアナジーを示すとともにRag2(-/-)KJ1-26+ CD25-Foxp3-T細胞の抗原特異的活性化に対して制御能を示した(図は論文中に掲載)。

[考察]

レシピエントタイプDC(regs)の投与ではマウスalloBMT後の皮膚cGVHDに対して著しい防御効果が認められた。レシピエントタイプDC(regs)は同種異系反応性CD4+T細胞に対し抗原特異的アナジーを誘導することが考えられた。また、レシピエントタイプDC(regs)によってレシピエントマウスにおいてドナー由来同種異系反応性CD4+CD25+Foxp3+TR細胞が誘導され、DC(regs)の皮膚cGVHDに対する防御効果に関与していることが考えられた。また移入実験より、DC(regs)はCD4+CD25-Foxp3-T細胞からCD4+CD25+Foxp3+TR細胞を抗原特異的に末梢誘導することが考えられた。

[結語]

本研究ではレシピエントタイプDC(regs)はマウスMHC一致・miHAg不一致alloBMTによる皮膚cGVHDに対して防御効果を示し、その作用機序にはドナー由来同種異系反応性CD4+CD25+Foxp3+TR細胞の抗原特異的な末梢誘導が関与することが明らかとなった。

図1 マウス皮膚cGVHDの症状とスコアリング

図2 DC(regs)のマウス皮膚cGVHDの発症率及び重症度に対する防御効果

図3 移植レシピエントマウスにおけるDC(regs)によるドナー由来CD4+CD25+Foxp3+TR細胞の誘導

図4 DC(regs)のマウス皮膚cGVHDの防御効果に対する抗CD25抗体を用いたin vivo阻害実験

本研究は同種異系骨髄移植(allogeneic bone marrow transplantation; alloBMT)において治療困難な合併症として問題となっている慢性移植片対宿主病(chronic graft-versus-host disease; cGVHD)に対して、マウス主要組織適合抗原複合体(major histocompatibility complex; MHC)一致・マイナー組織適合抗原不一致allo BMTモデルを用いて、T細胞制御機能をもつ制御性樹状細胞(regulatory dendritic cells; DC(regs))による新規免疫細胞療法の治療効果を検討したもので、下記の結果を得ている。

1. マウス骨髄細胞を改変してDC(regs)を作製した。DC(regs)は正常活性化成熟樹状細胞(mature dendritic cells; mDCs)と比較するとMHC分子の発現は中等度にみられたもののCD11cやCD40、CD80、CD86等の共刺激分子・共刺激分子リガンドの発現が著しく低下していた。またリポポリ多糖(lipopolysaccharide; LPS)による刺激にて、mDCsではインターロイキン-12p40(interleukin-12p40; IL-12p40)の顕著な産生がみられたのに対し、DC(regs)ではIL-10の強い産生が認められた。

2. in vitroのマウス同種異系細胞培養系において、mDCsは同種異系CD4+CD25-Foxp3-ナイーブT細胞を活性化してCD4+CD25+Foxp3-エフェクターT細胞を顕著に誘導したが、DC(regs) は同種異系CD4+CD25-Foxp3-ナイーブT細胞に免疫不応答性(アナジー)を誘導するだけでなく、同種異系反応性CD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞を誘導することが示された。

3. MHC一致・マイナー組織適合抗原不一致マウス間でalloBMTを施行後、レシピエントマウスへレシピエントタイプDC(regs) を投与すると、皮膚cGVHDの発症率及び重症度に対して著明な改善が認められ、その治療効果は免疫抑制剤rapamycinの投与による効果を顕著に上回った。一方、alloBMT施行後のレシピエントタイプmDCsの投与では病態は増悪した。

4. レシピエントマウスの免疫学的解析により、レシピエントタイプDC(regs)投与群ではドナー由来CD4+T細胞にアナジーが誘導され、ドナー由来同種異系反応性CD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞が顕著に誘導されていることが明らかとなった。また、抗CD25抗体を用いてCD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞を除去するとこの防御効果が著しく阻害された。さらに、レシピエントタイプDC(regs)投与群より得られたドナー由来CD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞をalloBMT時に養子移入するとcGVHDへの顕著な防御効果が認められた。これらの結果より、DC(regs)によるcGVHDの防御効果にはドナー由来同種異系反応性CD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞が関わっていることが示された。一方、レシピエントタイプmDCs投与群ではin vivoでドナー由来同種異系反応性CD4+CD25+Foxp3-エフェクターT細胞が誘導されていることが示された。

5. DC(regs)によるCD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞誘導機構の解明を目的として、卵白アルブミンペプチド特異的T細胞受容体を有し、かつCD4+CD25+Foxp3+内在性制御性T細胞を欠損するRag2(-/-)DO11.10 BALB/cマウスのT細胞を用いて移入実験を行った。その結果、CD4+CD25-Foxp3-ナイーブT細胞と卵白アルブミンペプチド添加DC(regs)の共移入にて、CD4+CD25-Foxp3-ナイーブT細胞に抗原特異的なアナジーが誘導されるだけでなく、CD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞が抗原特異的に末梢誘導されることが示された。

以上、本論文は、DC(regs) を用いた免疫細胞療法がマウスalloBMTモデルにおけるcGVHDに対して顕著な治療効果を示し、その作用機序にはDC(regs) による同種異系反応性CD4+CD25+Foxp3+制御性T細胞の抗原特異的な誘導を介した免疫寛容が関わることを明らかにした。本研究はヒトcGVHDの新規免疫療法の将来的な可能性も示唆するものであり、また一方でこれまで不明であった樹状細胞サブセットによる制御性T細胞の胸腺外末梢誘導を明らかにした点においても樹状細胞による免疫寛容誘導機構の解明に重要な貢献をなすものと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。