The leukocyte mono-Ig-like receptor (LMIR) belongs to a new family of paired immunoreceptors. In this paper, I identified LMIR3 and LMIR4 from a BMMC cDNA library as new members of the LMIR family and analyzed an activating receptor LMIR4/CLM-5 and an inhibitory receptor LMIR3/CLM-1 (Figure 1.).

LMIR4 is expressed in myeloid cells, including granulocytes, macrophages, and mast cells, whereas LMIR3 is expressed in myeloid cells and B cells. Intraperitoneal administration of lipopolysaccharide strikingly up-regulated LMIR3 and down-regulated LMIR4, whereas that of granulocyte colony-stimulating factor up-regulated both LMIR3 and LMIR4 in granulocytes. Collectively, these results suggest that the innate immune system is at least in part regulated by the qualitative and quantitative balance of the paired receptors LMIR3 and LMIR4.

LMIR4 contained only a short cytoplasmic tail and has a negatively charged residue, glutamic acid in the transmembrane domain. The association of LMIR4 with FcRγ among immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)- bearing molecules was indispensable for LMIR4-mediated functions of bone marrow-derived mast cells, but dispensable for its surface expression. Cross-linking of LMIR4 led to Lyn- and Syk-dependent activation of bone marrow-derived mast cells, resulting in cytokine production and degranulation, whereas that of LMIR3 did not. The triggering of LMIR4 and TLR4 synergistically caused robust cytokine production in accordance with enhanced activation of ERK, whereas the co-ligation of LMIR4 and LMIR3 dramatically abrogated cytokine production. Cross-linking of LMIR4 in bone marrow granulocytes also resulted in their activation, which was enhanced by lipopolysaccharide (Figure 2.).

LMIR3 posesses five cytoplasmic tyrosine residues (Y241, Y276, Y289, Y303, Y325) among which Y241 and Y289 fit the consensus sequence sequence of immunotyrosine-based inhibitory motif (ITIM) and Y325 fit the consensus sequence sequence of immunotyrosine-based switch motif (ITSM). Coligation of FcεRI and LMIR3 in BMMC significantly impaired the cytokine production induced by FcγRI crosslinking. In order to investigate the role of each tyrosine residue of LMIR3, we generated BMMC transduced with various LMIR3 mutants in which tyrosines were replaced with phenylalanines. As a result, the replacement of Y325 in addition to Y241 and Y289 with phenylalanine (Y241/289/325F) dampened the inhibitory function of LMIR3.

Interestingly, engagement of LMIR3 alone induced cytokine production in LMIR3 (Y241/289/325F) mutant- or LMIR3 (Y241/276/289/303/325F) mutant- transduced BMMC led to the significant cytokine production, indicating the existence of activating signal pathway independently of tyrosine phosphorylation of LMIR3. To explore whether LMIR3 associated with the adaptor protein, we performed immunoprecipitation experiments, demonstrating that ITAM-bearing FcRγ associated with LMIR3. The deficiency of FcRγ completely abolished the activating function of LMIR3 (Y241/276/289/303/325F). Collectively, LMIR3 transmits an inhibitory signal via Y241, Y289, and Y325, while does LMIR3 an activating signal by associating with FcRγ.

Furthermore, engagement of LMIR3 alone did not induce cytokine production in LMIR3 (WT), but in the presence of lipopolysaccharide, engagement of LMIR3 alone induced cytokine production, dependent on both cyoplasmic tyrosines and FcRγ. LMIR3, an inhibitory receptor, work as an activating receptor in the presence of lipopolysaccharide. (Figure 3.)

Although the identification of the ligands for LMIR3 and LMIR4 is indispensable for complete understanding of the functions, it has been unsuccessful despite an extensive trial using expression cloning or biochemical approaches. Fine-tuning of LMIR3, LMIR4, and their ligands might provide a new therapeutic strategy in the regulation of allergy and innate immunity. To fully understand the mechanism of LMIR3 and LMIR4 functions, further studies using knock-out mice are now under way.

Figure 1.

Figure 2.

Figure 3.

本研究は自然免疫において重要な役割を演じていると考えられるLMIR(CD300)ファミリーに属する新規のペア型レセプターであるLMIR3, LMIR4を同定し、機能解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1.LMIR3, LMIR4のクローニングと発現の確認

すでに報告されているLMIR1, LMIR2とホモロジーを持つ分子をデータベースにて検索し、新規のペア型レセプターであるLMIR3, LMIR 4を同定し、クローニングを行った。LMIR3, LMIR4はそれぞれ337,221アミノ酸から成るI型膜貫通蛋白で、細胞外ドメインは91%という非常に高いホモロジーを持つ。LMIR4はリーダー配列、免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域(非典型的に負荷電アミノ酸であるグルタミン酸を持つ)、短い細胞内領域から成り、活性型レセプターであることが予測された。LMIR3は細胞質内に5つtyrosineを持ち(以後Y1~Y5と略する)、そのうちY1とY3がITIM配列に、Y5がITSM配列に一致するため、抑制型レセプターであることが予測された。

組織のRT-PCRや特異的抗体によるFACSを行った結果、LMIR4は顆粒球で発現が高く、LMIR3はミエロイド系だけでなくB細胞でも発現が認められた。また、LMIR3, LMIR4ともに気管や肺にも発現が認められた。また、G-CSFやLPS投与によるLMIR3, LMIR 4の発現レベルの変化をFACSにて検討した。in vivoにおいてもin vitroにおいてもG-CSFを投与時にはLMIR3, LMIR4供に発現が上昇したが、LPS 投与時にはLMIR3の発現は上昇するがLMIR4の発現は低下した。これらは、感染時に細胞表面へのLMIR3, LMIR4の発現の割合が変化して、対応している可能性を示唆すると考えられた。

2. LMIR4の機能解析

LMIR4とITAMまたはITAM-like motif を持つアダプター蛋白との結合を293T細胞への強制発現系を用いて検討したところ、LMIR4とFcRγの強い結合とそれに伴うLMIR4の安定化が認められ、LMIR4がFcRγと会合することが示された。

骨髄由来マスト細胞(bone marrow derived mast cell: BMMC)において、過剰発現させたLMIR4を架橋したところ、各種MAPK, AKTのリン酸化、炎症性サイトカイン(IL-6)の産生、脱顆粒などが認められた。この活性化シグナルはFcRγKO, LynKO ,SykKOにて完全に消失した。以上よりLMIR4の架橋によるサイトカイン産生はFcRγ, Lyn, Syk依存性であることが示された。

また、BMMC において、過剰発現させたLMIR4を架橋すると同時にLPSを加えると、サイトカイン産生、ERK, AKTのリン酸化に著明な相乗効果が認められた。

3.LMIR4特異的抗体にて顆粒球が活性化される

マウス骨髄から分離した顆粒球をLMIR4特異的抗体にて刺激したところ、プレートへの接着の増加、IL-6, TNF-αなどの炎症性サイトカインの産生といった顆粒球の活性化が認められた。また、LPSと内因性LMIR4の架橋に相乗作用が認められた。LMIR4は自然免疫に重要な役割を果たしている可能性が示された。

4.LMIR3特異的抗体にてマスト細胞のFcεRIのシグナルが抑制される

BMMCにおいて、FcεRI とLMIR3を共架橋すると、FcεRI の架橋によるサイトカイン産生が抑制された。その際、共架橋後早期にLMIR3のチロシンがリン酸化され、それにひき続き、ERKのリン酸化レベルが抑制された。LMIR3はITIM, ITSMを持つので、抑制作用を持つことが予想されるが、LMIR3がFcεRIのシグナルを抑制することが初めて示された。

LMIR3の抑制作用におけるLMIR3のtyrosineの役割を明らかにするために、様々なYFmutant(tyrosineをphenylalanineに置換したコンストラクト)を発現させたBMMCを作成し、抑制作用を検討した。 その結果、ITIMに一致するY1とY3だけでなくITSMに一致するY5のtyrosineもphenylalanineに置換したLMIR3(Y1/3/5F)においてLMIR3の抑制作用が完全に消失した。以上よりLMIR3の抑制作用には、ITIM(Y1, Y3)とITSM(Y5)の両方が重要であることが示された。

5.LMIR3はSHP-1/SHP-2, p85α, Grb2と会合する

LMIR3を発現させたBa/F3細胞をVO4で刺激し共沈実験を行った。チロシンリン酸化したLMIR3はフォスファターゼのSHP-1/SHP-2と会合するが、SHIPとは会合しないことが示された。また、PI3Kのサブユニットであるp85αやGrb2とも会合が認められた。様々なLMIR3YFmutantを発現させたBa/F3細胞を用いて同様の実験を行った結果、p85αはリン酸化したY2と、SHP-1/SHP-2はリン酸化したY1, Y3, Y5と会合する事が明らかになった。

6.LMIR3(Y1/3/5F), LMIR3 (YallF)は活性化に働く

抑制作用を消失させたLMIR3(Y1/3/5F)をBMMCに発現させ、架橋するとサイトカインの産生が認められ、活性化作用を示した。このことは、Y2とY4のリン酸化が活性化シグナルに関与することを示唆している。しかし、5つのtyrosine全てをphenylalanineに置換したLMIR3(YallF)においても有意なサイトカイン産生が認められ、tyrosineのリン酸化とは別の活性化経路の存在が示唆された。

一般には抑制型レセプターとITAMまたはITAM-like motif を持つアダプター蛋白の結合は知られていないが、LMIR3に関してその可能性を検討したところ、LMIR3とFcRγの会合が認められた。

FcRγKOのBMMCにおいてLMIR3(Y1/3/5F)を架橋した時にはERKのリン酸化やサイトカイン産生が顕著に低下し、また、LMIR3(YallF)を架橋した時にはサイトカイン産生が完全に消失することが示された。以上より、LMIR3を介する活性化シグナルにはFcRγが必須であることが明らかになった。ITIMを細胞質内に持ち、抑制作用を示すレセプターがITAMを持つアダプター分子と会合するとの報告は例がなく、新規である。

7.LMIR3(WT)はLPS存在下で活性化に働く

LMIR3(WT)を単独で架橋しても、サイトカイン産生は認められないが、LPS存在下にてLMIR3(WT)の架橋を行うと、LPSによるサイトカイン産生が増強されることが示された。この活性化作用にはFcRγと細胞質内のtyrosineの両方が寄与していることが、明らかとなった。

以上より、LMIR3はマスト細胞において、FcεRIに対しては細胞内領域のITIMとITSMを介して抑制化シグナルを伝えるが、一方で、LPS存在下においては、ITAMを有するFcRγとの会合を介して活性化シグナルを伝達するという二重機能を持つことが明らかとなった。

以上、本論文はLMIR(CD300)ファミリーに属する新規のペア型レセプターであるLMIR3, LMIR4の機能解析により、LMIR3, LMIR4が自然免疫に寄与することが示唆された。このことは、ペア型レセプターの免疫生物学的機能解明に貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。