【背景・目的】

尿酸はヒトにおけるプリン化合物の最終代謝物であり、主に肝代謝による生成と腎臓からの尿中排泄によって恒常性が維持されている。霊長類以外の哺乳類ではUricaseにより尿酸はAllantoinへと代謝排泄されるが、ヒトではUricaseが遺伝的に機能欠損しており、代謝経路が存在しない。このため、主要排泄経路である尿中排泄の異常は尿酸恒常性破綻によって生じる各種疾患の主な原因となる。特に、日本人において高尿酸血症患者の約8割、低尿酸血症患者の約9割に尿中排泄異常が観察され、尿酸恒常性維持における尿中排泄経路の重要性が伺える。高尿酸血症では痛風、虚血性心疾患等の、低尿酸血症では尿路結石、運動誘起性腎不全等のリスク上昇が知られている。このため、尿酸尿中排泄機構の解明は尿酸恒常性維持の解明につながり、臨床的観点においても重要である。

尿酸尿中排泄量は、糸球体ろ過量の10%程度しか観察されないため、尿中に排泄された大部分の尿酸は管腔側から血液中へと再び吸収を受ける。Probenecid(PRB)およびbenzbromaron(BZB)は尿酸尿中排泄量を増加させる尿酸排泄促進薬であり、抗結核薬pyrazinamide(PZA)はその副作用として尿酸尿中排泄量を低下させることが知られている。PRBおよびBZBの尿中排泄促進機構として腎再吸収阻害が、PZAの尿中排泄阻害機構として尿中への分泌阻害が考えられてきた。さらに、PRBはPZAとの併用時にも尿酸排泄を促進するが、BZBの尿酸排泄促進効果は消失することが知られている。これらの臨床的知見は、尿酸再吸収過程に2つの異なる輸送機構を仮定することで説明されてきた。

尿酸腎再吸収に働くトランスポーターとしてURAT1/SLC22A12が同定された。URAT1は近位尿細管管腔膜側に発現する尿酸再吸収トランスポーターであり、低尿酸血症患者において高頻度で機能欠損につながる変異が観察されている。さらに、URAT1機能欠損者では、PRBとBZBおよびPZAの薬理作用が消失することが報告されている。つまり、PRB、BZBおよびPZAから得られたこれまでの臨床的知見は、すべてURAT1による尿酸輸送の表現型であることが示唆され、2つの異なる再吸収機構を仮定した従来の仮説に反する。そこで、本研究ではURAT1の尿酸輸送特性に着目し、PRB、BZB、PZAの各薬物の単独・併用時の薬理効果を説明するために尿酸尿中排泄機構を明らかにすることを目的とした。(1)URAT1はアニオン-尿酸交換輸送体であり、細胞内に濃縮された乳酸やPZAの酸性代謝物であるpyrazinoate(PA)により、細胞外からの尿酸取り込み促進が報告されている。このアニオン-尿酸交換輸送体としての性質に着目し、PZAによる尿酸排泄阻害機構が尿酸尿中分泌阻害ではなく、尿酸腎再吸収促進であると考えた。(2)PZA併用時にPRBは尿酸排泄促進作用を有している、一方BZBの尿酸排泄促進作用は消失する現象は、PA細胞内取り込みに対する阻害能の違いに由来するものと考えた。つまり、PRBはURAT1機能促進効果の原動力となるPA取り込みを阻害することにより、PAの尿酸排泄阻害効果を打ち消すことができるが、BZBはURAT1のみを阻害するため、PA存在下(PAによるURAT1尿酸再吸収促進時)では尿酸尿中排泄クリアランスを上昇させない。この2つの仮説を実証するため、以下の実験を行った。

【方法・結果】

マウスin vivo試験においてPA、PRB、BZBの尿酸腎クリアランスへの影響を検討したところ、PAによる尿酸排泄抑制作用および、BZB、PRBによる尿酸排泄促進作用が観察された。さらに、近位尿細管においてURAT1がS2およびS3部位に高いmRNA発現量を示したことから、S2およびS3部位に相当する近位直尿細管を用いて単離尿細管試験を行った。その結果、近位直尿細管においてBZB、PRBによる尿酸再吸収率の有意な低下および、PAプレロードによる尿酸再吸収率の上昇が観察された。

次に、PAによる尿酸取り込み促進の分子メカニズムについて検討を行った。過去の報告より、細胞内にPAの外向き濃度勾配を形成させた場合、URAT1を介した尿酸取り込みの促進が生じることが知られている。このため、腎臓におけるPA外向き濃度勾配を形成する、PA取り込みトランスポーターに着目した。遺伝子発現細胞を用いたPA取り込み試験より、hSMCT1およびhSMCT2発現細胞において有意なPA取り込みクリアランスの上昇が観察された。一方、hURAT1発現細胞ではPA取り込みクリアランスの上昇が観察されず、URAT1単独ではPAによる尿酸取り込み促進作用が生じないと予想される。そこで、hSMCT1/hURAT1またはhSMCT2/hURAT1二重発現細胞を作成し、PAによるURAT1を介した尿酸再吸収促進作用を検討した。その結果、hSMCT1/hURAT1およびhSMCT2/hURAT1二重発現細胞において、プレロードしたPA濃度依存的な尿酸取り込みクリアランスの上昇が観察された。一方、hURAT1、hSMCT1およびhSMCT2単独発現細胞においてはPAプレロードによる尿酸取り込みクリアランスの上昇は観察されず、PA取り込みトランスポーターにより形成されるPA外向き濃度勾配が、URAT1の輸送活性促進には必要であることが示唆された。

次に、PRBとBZBの尿酸排泄促進メカニズムの差異について検討を行った。尿細管管腔側および側底膜側のPA取り込み機構に対するBZBおよびPRBの阻害能を検討したところ、BZBは何れのPA取り込み機構に対し阻害作用を示さなかった。一方、PRBはmSmct1およびマウス腎スライスにおけるPA取り込みを有意に阻害した。mSmct1に対するPRBのIC50値は199μMであり、マウス腎スライスに対しては17.5HMである。マウスにおけるPRB薬理作用発現時の非結合型血漿中濃度215μMとの比較により、in vivo条件においてもPRBによるPA取り込み阻害作用が予想される。そこで、in vivo試験においてPAの尿中排泄に対するBZBおよびPRBの影響を検討したところ、PRB投与群においてのみPA腎クリアランスおよび腎臓-血漿中濃度比の低下が観察された。これらの結果より、PRBはPAの腎側底膜側取り込みを阻害することが明らかとなった。さらに、マウス腎スライスを用いて腎側底膜側PA取り込み機構に対する検討を行った。その結果、BZBによって阻害されないが、PRBによって阻害を受ける、マウス腎スライスにおけるPA取り込み機構は、OAT1およびOAT3それぞれの阻害剤であるρ-aminohippurateおよびestrone-3-sulfateによって阻害されないことが明らかとなった。一方、MCTファミリーの阻害剤であるα-cyano-4-hydroxycinnamateおよびρ-chloromercuri benzene sulphonicacidによってPA取り込みは有意に阻害されることが明らかとなった。以上より、マウス腎スライスにおけるPA取り込み機構には、MCTファミリーに属するトランスポーターの寄与が大きいと予想される。

【考察・議論】

本研究の結果、PZAによる尿酸尿中排泄量の低下は、従来の仮説とは異なりその代謝物であるPAのURAT1機能促進による再吸収促進の結果であることが明らかとなった。さらに、PAはアニオン化合物であるため、その細胞内取り込みにはトランスポーターを介した効率的な輸送が必要である。尿酸排泄促進薬であるPRBとBZBがPZAへ存在下で異なる薬理作用を示す機構として、PRBがPAの腎取り込みトランスポーターを阻害し、PAによる再吸収促進効果を減弱させるのに対して、BZBはURAT1選択的でありPAの腎臓内動態に影響を与えないためであることが示唆された。当初、PA腎内取り込み機構として、内因性駆動力として働く乳酸の腎再吸収トランスポーターSMCT1/2を考えていたが、マウスin vivo試験の結果、側底膜側の取り込み機構がPAの腎臓内濃度を決定する重要な要因であった。このPA基底膜側取り込みには、乳酸輸送トランスポーターMCTファミリーが関与していることが示唆された。以上より、古典的モデルでは説明困難であった尿酸尿中排泄機構を、URAT1およびURAT1の輸送駆動力を形成するトランスポーターにより、合理的に説明することができた。尿酸尿中排泄機構の実体解明により、尿酸排泄異常に起因する種々の臨床症状への理解に役立つものと考えている。

本研究において申請者は、ヒトにおける重要な尿酸恒常性維持メカニズムである、尿中排泄メカニズムの検討を行っている。尿酸はヒトにおけるプリン化合物の最終代謝物であり、主に肝代謝による生成と腎臓からの尿中排泄によって恒常性が維持されている。霊長類以外の哺乳類ではUricaseにより尿酸はAllantoinへと代謝排泄されるが、ヒトではUricaseが遺伝的に機能欠損しており、代謝経路が存在しない。このため、主要排泄経路である尿中排泄の異常は尿酸恒常性破綻によって生じる各種疾患の主な原因となる。高尿酸血症では痛風、虚血性心疾患等の、低尿酸血症では尿路結石、運動誘起性腎不全等のリスク上昇が知られている。また、日本人において高尿酸血症患者の約8割、低尿酸血症患者の約9割に尿中排泄異常が観察され、尿酸恒常性維持における尿中排泄経路の重要性が伺える。

これまでに、尿酸の尿中排泄メカニズムに関する主な知見として、(1)尿酸は糸球体ろ過量の10%程度しか尿中に排泄されない腎再吸収優位な化合物である、(2)Probenecid(PRB)およびbenzbromaron(BZB)は尿酸尿中排泄量を増加させる尿酸排泄促進薬であり、抗結核薬pyrazlnamide(PZA)はその副作用として尿酸尿中排泄量を低下させる、(3)PRBはPZAとの併用時にも尿酸排泄を促進するが、BZBの尿酸排泄促進効果が消失することが知られている。これらの知見を説明しうる有力な仮説として、糸球体ろ過、分泌前再吸収、尿細管分泌、分泌後再吸収の4つの過程からなる4-コンポーネントモデルが提唱されている。しかし、申請者は近年明らかになりつつあるトランスポーター研究の進展の成果から、この仮説に疑問を感じ、新たな尿酸尿中排泄モデルの構築を試みた。URAT1は腎近位尿細管刷子縁膜側に発現する、尿酸-有機アニオン交換輸送トランスポーターであり、尿酸腎再吸収に関与していると考えられている。さらに、URAT1の機能低下者においてPRB、BZB、PZAの尿酸排泄への作用が消失するという報告がなされている。これらの報告より、以下のような矛盾点が明らかとなった。(1)4-コンポーネントモデルにおいて尿中分泌阻害の結果だと考えられていたPZAの尿酸排泄抑制作用が、どの様に腎再吸収トランスポーターURAT1を介して生じるのか、(2)異なる再吸収部位を阻害すると考えられていたPRBとBZBがともにURAT1を阻害するにも関わらず、なぜ異なる尿酸排泄促進作用を示すのか。そこで、申請者はこれらの4-コンポーネントモデルと近年明らかとなったURAT1機能の両方を説明可能な尿酸排泄モデルとして、次のような仮説を提案した。(1)PZAの尿酸排泄抑制作用は、活性代謝物Pyrazinoate(PA)の腎内蓄積により生じる、URAT1を介した尿酸腎再吸収促進作用である。(2)PZA併用時に生じるPRBとBZBの尿酸排泄促進作用の違いは、PRBとBZBによるPA腎蓄積阻害の違いにより生じる。これら仮説を検証するため、申請者は以下のような検討を行った。

1.Pyrazinoic acidによるUric acid排泄抑制効果の解明

URAT1機能低下者における臨床試験から、PZAの尿酸排泄抑制作用はUIUT1機能に依存して生じる事が明らかとされている。しかし、PZA自身は細胞内または細胞外に添加しても、URAT1を介した尿酸輸送に対し影響を与えないことがin vitro試験より報告されている。一方で、PZAの活性代謝物であるPAを含む溶液を細胞内に注入することにより、URAT1を介した尿酸輸送能を促進することが報告されている。これらの背景を基に、申請者はPAによるURAT1輸送能促進作用に対して、URAT1だけでなくPA取り込みトランスポーターもまた必要であると考え検討を行った。その結果、URAT1と同じく腎近位尿細管刷子縁膜側に発現する乳酸トランスポーターSMCT1およびSMCT2がPAを輸送することを明らかにし、かつSMCT1/URAT1またはSMCT2/URAT1二重発現細胞において、PAが尿酸取り込み促進作用を示すことを明らかとした。これに対し、SMCT1、SMCT2、URAT1各単独発現細胞ではPAによる尿酸取り込み促進作用は観察されなかった。さらに、PRB、BZBによる尿酸排泄促進作用より、URAT1機能が確認されているマウスにおいて、近位尿細管S1、S2、S3各部位でのSMCT1、SMCT2、URAT1のmRNA発現量を検討した。その結果、S2およびS3部位においてURAT1およびSMCT1のmRNAが相対的に高い発現を示すことを明らかとした。そこで申請者は、近位尿細管S2およびS3部位に相当する近位直尿細管を用いてマウス単離尿細管微小灌流試験を行い、PAの細胞内へのプレロードが尿酸腎再吸収を促進することを確認している。これらの検討により、PZAの活性代謝物PAによる尿酸排泄抑制作用には、URAT1ならびにPAのURAT1発現細胞内への蓄積が必要であることを明らかにしている。

2.Probenecid、Benzbromarone薬理作用機構の解明

URAT1阻害剤であるPRBおよびBZBは、尿酸排泄抑制作用を示すPZA併用時に異なる尿酸排泄促進作用を示すことが知られている。PRBはPZA併用時にも尿酸排泄促進作用を示すが、BZBは示さなくなることが、臨床試験より報告されている。そこで、この現象のメカニズムとして申請者は、PZAの活性代謝物であるPAの腎蓄積に対する阻害作用の差により、PZA併用時の尿酸排泄促進作用の差が生じると仮説を提唱している。先の検討において、PAによるURAT1を介した尿酸輸送促進作用には、URAT1だけでなくPAの腎蓄積を生じさせるPAトランスポーターもまた必要であることが明らかにされている。すなわち、PRBはPAの腎蓄積を阻害することにより、PZA併用時においても尿酸排泄促進作用を示すことができるが、BZBはPA腎蓄積を阻害できないため、尿酸排泄促進作用が消失すると考えられる。初めに、申請者はマウスにおいてもヒトと同様に、PA併用時においてPRBの尿酸排泄促進作用が維持されること、およびBZBの促進作用が消失することを確認している。さらに、マウスin vivo試験においてPREがPA腎蓄積および腎クリアランスを低下させるが、BZBはPA腎蓄積に影響を与えないことを観察している。これらの結果より申請者は、PRBによるPAの腎蓄積阻害は腎クリアランスの低下を伴うことから、刷子縁膜側PA取り込み機構の阻害ではなく、腎側底膜側取り込み機構の阻害だと報告している。先の検討において、腎刷子縁膜側に発現するSMCT1およびSMCT2がPAを細胞内に取り込むことが確認されている。SMCT1およびSMCT2は乳酸腎再吸収に関与することがノックアウトマウスを用いた検討より報告されており、申請者もまた乳酸腎クリアランスの測定によりPRBによるSMCT1またはSMCT2への作用を検討したが、乳酸腎クリアランスの上昇は観察されなかった。一方、本検討において観察された腎側底膜側のPA取り込み機構に関して、マウス腎スライスを用いた検討を行っている。その結果、申請者は腎側底膜側におけるPA取り込みが、乳酸トランスポーターMCT1およびMCT4の阻害剤であるα-cyano-4-hydroxycinnamateおよびρ-chloromercuri benzene sulphonic acidによって阻害されることを確認している。ただし申請者は同時に、MCT1およびMCT4のmRNAがURAT1の機能が確認された近位尿細管S2およびS3部位には検出されなかったことから、他のトランスポーターの寄与を想定している。以上より、本検討においてPRBによるPA腎蓄積阻害作用およびBZBは阻害作用を持たないことが確認された。このため、申請者はPZA併用時におけるPRBおよびBZBの尿酸排泄促進作用の違いは、PA腎蓄積に対する阻害作用の違いによると提唱している。

以上の解析より、申請者は(1)PZAによる尿酸排泄抑制作用が、活性代謝物PAの腎蓄積により生じるURAT1機能促進であること、(2)PZA併用時におけるPRBとBZBの尿酸排泄促進作用の違いが、PA腎蓄積への阻害作用の違いで説明できることを明らかとした。さらに、これらの成果を基に申請者は、新規低尿酸血症原因遺伝子および新規高尿酸血症発症メカニズムを提唱している。低尿酸血症は大きく分けて、PRB、BZB、PZAの作用が消失するタイプと、PRB、BZBの作用は消失するが、PZAの作用は観察されるタイプに分けられる。前者は、低尿酸血症患者の多くを占め、原因遺伝子としてURAT1が同定されている。一方、後者に関しては未だ原因遺伝子が不明である。本検討において申請者は、PZAの作用はURAT1の輸送能と、腎側底膜側PA取り込み機構により生じることを明らかとした。一方、SMCT1およびSMCT2は腎刷子縁膜側において乳酸腎再吸収によりURAT1を駆動するトランスポーターであることが知られている。このため、SMCT1およびSMCT2の機能低下者においては、URAT1内因性駆動力低下により低尿酸血症が生じるが、PA取り込み機構が正常であるためPZAの作用は観察されると考えられる。また、本検討で示したようにPZAによって生じる高尿酸血症は、URAT1を介した尿酸腎再吸収促進だと考えられる。このため、薬物の副作用として高尿酸血症が生じるメカニズムの一つとして、腎内に薬物が取り込まれた結果生じるURAT1機能促進が予想される。

以上、申請者は尿酸尿中排泄メカニズムを解明することにより、新たな高尿酸血症および低尿酸血症発症メカニズム解明の糸口をつけた。申請者が解明した尿酸排泄メカニズムは尿酸恒常性異常により生じる種々の疾患解明に役立つと考え、本検討が博士(薬学)の学位を授与するに値するものと認めた。