【背景と目的】

腫瘍抗原を標的とする癌の免疫療法における最大の障壁は、その抗原に対する免疫寛容である。多くの腫瘍抗原は、正常組織にも発現する自己抗原であり、この免疫寛容を打破し、効率よく腫瘍増殖を抑制するが、正常組織を傷害しない免疫療法が理想的である。このような免疫療法の開発を目指した研究は、実際にヒトで免疫応答が起こることの知られている標的腫瘍抗原について行うべきである。さらに、腫瘍の増殖している微少環境下での、免疫細胞による免疫応答の、腫瘍増殖抑制機構を明らかにする必要がある。しかし、腫瘍抗原に対する免疫寛容が形成される機構はこれまで明らかでなかった。

MUC1を標的とする癌治療の研究に用いられてきたヒトMUC1トランスジェニックマウス(MUG1.Tgマウス)は、MUC1に対して免疫寛容であるとされるが、その機構は未知であった。そこで本研究では、MUG1.Tgマウスの免疫寛容のメカニズムを明らかにし、従来実現されていなかった効果的なMUC1を標的とする癌ワクチンを開発するための基礎とすることとした。

【方法と結果】

1.MUC1.Tgマウスに移植されたMUC1発現大腸癌細胞は増殖性が高かった

大腸癌の同所移植モデルにおいて、MUC1.TgマウスはMUC1発現癌細胞に対して免疫寛容を示すかどうかを明らかにするために、マウス大腸癌高肝転移性細胞株SL4にヒトMUC1を強制発現させたSL4-MUC1、またはMUC1を含まないベクターを導入したSL4-mockをマウスの盲腸漿膜下に移植した。2週間後に犠牲死させ、腫瘍の増殖を臓器重量を指標として評価した。MUC1発現大腸癌細胞はC57BL/6野生型マウス(B6マウス)では、非発現細胞と同程度の増殖性を示したが、MUC1.Tgマウスでは非発現細胞より増殖しており、腫瘍増殖は同細胞のB6マウスにおけるそれより高かった(図1)。この結果から、腫瘍増殖を抑制する応答がいずれの細胞に対しても起るが、MUC1.Tgマウスでは免疫寛容のために、MUC1発現細胞による腫瘍増殖が元進した可能性が考えられた。

2.MUC1.TgマウスではSL4-MUC1に対する免疫応答が抑制されていた

MUC1.TgマウスにSL4-MUC1細胞を移植したときの、腫瘍内T細胞の活性化状態を、活性化エフェクター丁細胞(Teff)と、末梢での免疫寛容に重要であることが知られている制御性T細胞(Treg)の数の比率に注目してB6マウスとMUC1.Tgマウスを比較した。SL4-MUG1細胞を盲腸に移植後5、10日後に腫瘍移植部位を摘出し、コラゲナーゼで消化して細胞を調製後に、フローサイトメトリー法により、CD4+CD25+F。xp3+Treg細胞とCD4+CD25+Foxp3-Teff細胞のCD4+細胞集団内における割合を調べた(図2A、2B)。また、Treg細胞とTeff細胞の比を算出することで、個々の動物における免疫応答が、活性化または抑制のどちらに傾いているのかを明らかにした(図2C)。腫瘍移植10日後にはB6マウスではTreg細胞の割合は減少し、Teff細胞の占める割合が多くなり、腫瘍に対して免疫応答が起こっていることが示唆された。一方、MUC1.TgマウスではTefF細胞の増加が有意に抑制され、結果としてB6マウスと比べて高いTreg/Teff比が保たれていた。このことからMUC1.TgマウスではSL4-MUC1に対する免疫応答が抑制されていることが、腫瘍内T細胞亜集団の性質として示された。

3.MUC1.TgマウスにはMUC1に対する末梢免疫寛容が存在した

図2に示した実験結果から、MUC1.Tgマウスでは腫瘍内でTefr細胞の増加が抑制されていることが明らかになった。しかし、MUC1.Tgマウスでは中枢性免疫寛容によってMUC1に反応することのできる丁細胞の数が減少している可能性があるため、MUC1に対する免疫応答を末梢で抑制する末梢性免疫寛容が存在するかどうか、またTreg細胞がそれに関わっているかどうかは不明だった。そこでMUC1.TgマウスにMUC1特異的な末梢性免疫寛容が存在するのかどうかを明らかにするため、MUC1.Tgマウスをレシピエントとして、抗原特異的に活性化したT細胞と腫瘍細胞を混合して移植を行うことによって腫瘍特異的なT細胞の活性化を測定できるWinn assayを行った。B6マウスをMUCl DNAワクチンで免疫することにより、MUC1特異的なT細胞を活性化させこれらの細胞を脾臓から調製し、MUC1を強制発現させたB16-F10メラノーマ細胞と混合し、ナイーブなB6マウスまたはMUC1.Tgマウスの皮下に移植した。B6マウスをレシピエントにした場合、MUC1特異的な丁細胞の効果によって腫瘍は完全に拒絶されたが、MUCITgマウスをレシピエントにした場合には、MUC1特異的なT細胞が存在するにも関わらず、腫瘍の増殖が認められ、全てのマウスは最終的に死亡した(図3)。このことから、MUC1.TgマウスにはMUC1特異的な丁細胞による腫瘍細胞の増殖を抑制する効果を、末梢で抑制する機構が存在することが示された。

4.MUC1.Tgマウス由来のTreg細胞はMUC1特異的に丁細胞応答を抑制した

図2及び3に示した結果から、MUC1-Tgマウスにおける、MUC1に対する末梢性免疫寛容による腫瘍細胞の増殖において、Treg細胞が重要な役割を果たしている可能性が考えられた。そこでMUC1.TgマウスのTreg細胞がMUC1特異的に免疫応答を抑制するかどうかを以下の方法で調べた。T細胞ハイブリドーマであるVF5細胞は抗原提示細胞によって提示されるMUC1ペプチドに反応してIL-2を産生するので、MUC1特異的T細胞活性化の指標となる。そこで、B6マウスまたはMUC1.Tgマウスから分離したCD4+CD25+Treg細胞を加え、IL-2産生の低下から免疫抑制能を評価した。コントロールとして加えたCD4+CD25-のナイーブT細胞は歪L-2の産生を抑制しないのに対して、CD4+CD25+のTreg細胞を加えるとVF5細胞によるのIL-2産生はTreg細胞の細胞数依存的に抑制された(図4A)。さらに、B6マウス由来のTreg細胞と比較してMUC1.Tgマウス由来のTreg細胞は、より強力にVF5細胞によるIL-2産生を抑制した。一方、MUC1と関係の無い卵白アルブミン(OVA)を感作させたB6マウスより単離した、OVA特異的CD4+T細胞(Tova)によりOVA特異的に産されるIL-2に対する抑制能は、B6マウスとMUCtTgマウス由来のTreg細胞の間で差が無かった(図4B)。これらの結果から、MUC1.TgマウスのTreg細胞にはMUC1特異的なT細胞応答をMUC1特異的に抑制する細胞集団が含まれることが示された。

【まとめと考察】

MUC1.TgマウスのMUC1に対する免疫寛容による抗腫瘍免疫抑制のメカニズムとして、末梢での免疫寛容が存在することを明らかにした。また、その機構に関与すると考えられるTreg細胞にはMUC1特異的に免疫応答を抑制する細胞集団が存在することを示した。T細胞レセプタートランスジェニックマウスを用いずに、抗原特異的なTreg細胞がナイーブなマウスで存在することを示した報告、またそのTreg細胞が抗原特異的に免疫応答を抑制するという報告は今までになかったので、免疫抑制の機構を理解する上で全く新しい知見が得られたと言える。このMUC1特異的Treg細胞はMUC1のどのようなペプチド配列を認識しているのか、またMUC1上の糖鎖構造が変化することによって、認識が変化するのかを明らかにすることが今後の課題である。本研究によって示された1MUC1特異的Treg細胞を減少させ、あるいは効果を減弱させることにより、MUC1.Tgマウスで特異的な免疫寛容を打破しMUC1を発現する癌細胞に対する免疫治療の効果を上昇させることが可能になると考えられる。従来から、Treg細胞は癌の免疫治療の効果を上昇させるための障壁であり、ターゲットであると考えられてきたが、Treg細胞を全身的に除去するような方法によって、過剰な免疫応答を抑制することができずに、自己免疫疾患が誘導されるといった、副作用が懸念されている。本研究で示されたような、抗原特異的なTreg細胞をターゲットにすることにより、このような副作用が軽減できる可能性があり、癌の免疫治療の新たな可能性を提示することができたと考えられる。

〈図1〉MUC1発現、非発現大腸癌細胞を同所移植したときの腫瘍の増殖

〈図2〉MUC1発現大腸癌細胞を移植後の腫瘍都位におけるCD4+TregまたはTeff細胞の割合

A.CD4+細胞中のTreg細胞の割合B,CD4+細胞中のTeff細胞の割合C,Treg細胞とTeff細胞の比

〈図3〉MUC1発現腫瘍細胞とMUC1特異的T細胞を混合して移植した際のマウスの生存率

〈図4〉MUC1.Tgマウスより単離したTreg細胞によるMUC1またはOVA特異的T細胞応答の抑制効果の評価

A,MUC1特異的T細胞応答におけるTreg細胞の抑制効果B,OVA特異的T細胞応答におけるTreg細胞の抑制効果

「抗原特異的な抗腫瘍免疫応答におけるCD4陽性T細胞の役割とワクチンへの応用」と題する本研究において、学位申請者は腫瘍抗原を標的とする癌の免疫療法における最大の障壁は、その抗原に対する免疫寛容であると考え、その機構の解明を目指して研究を行った。MUC1トランスジェニックマウス(MUC1.Tgマウス)を用いた解析から、末梢において抗原特異的なT細胞の抑制が見られる事を明らかにした。多くの腫瘍抗原は、正常組織にも発現する自己抗原であり、この免疫寛容を打破し、効率よく腫瘍増殖を抑制するが、正常組織を傷害しない免疫療法が理想的であるが、腫瘍抗原特異的な免疫寛容を打破する事を目指した免疫療法の開発はこれまで試みられていなかった。本研究は、腫瘍の増殖している微少環境下で、免疫応答を抗原特異的に誘導する免疫寛容が形成される機構を追求した。また、MUC1.Tgマウスの免疫寛容のメカニズムを明らかにし、従来実現されていなかった効果的なMUC1を標的とする癌ワクチンを開発するための基礎とすることが目指された。

第一部では、MUC1.Tgマウスに移植されたMUC1発現大腸癌細胞は増殖性が高かった大腸癌の同所移植モデルにおいて、MUC1.TgマウスはMUC1発現癌細胞に対して免疫寛容を示すかどうかを明らかにするために、マウス大腸癌高肝転移性細胞株SL4にヒトMUC1を強制発現させたSL4-MUC1、またはMUC1を含まないベクターを導入したSL4-mockをマウスの盲腸漿膜下に移植した。2週間後に犠牲死させ、腫瘍の増殖を臓器重量を指標として評価した。MUC1発現大腸癌細胞はC57BL/6野生型マウス(B6マウス)では、非発現細胞と同程度の増殖性を示したが、MUC1.Tgマウスでは非発現細胞より増殖しており、腫瘍増殖は同細胞のB6マウスにおけるそれより高かった。この結果から、腫瘍増殖を抑制する応答がいずれの細胞に対しても起るが、MUC1.Tgマウスでは免疫寛容のために、MUC1発現細胞による腫瘍増殖が亢進した可能性が考えられた。

第二部では、MUC1.TgマウスではSL4-MUC1に対する免疫応答が抑制されていることを示した。MUC1.TgマウスにSL4-MUC1細胞を移植したときの、腫瘍内T細胞の活性化状態を、活性化エフェクターT細胞(Teff)と、末梢での免疫寛容に重要であることが知られている制御性T細胞(Treg)の数の比率に注目してB6マウスとMUC1.Tgマウスを比較した。SL4-MUC1細胞を盲腸に移植後5、10日後に腫瘍移植部位を摘出し、コラゲナーゼで消化して細胞を調製後に、フローサイトメトリー法により、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞とCD4+CD25+Foxp3-Teff細胞のCD4+細胞集団内における割合を調べた。また、Treg細胞とTeff細胞の比を算出することで、個々の動物における免疫応答が、活性化または抑制のどちらに傾いているのかを明らかにした(図2C)。腫瘍移植10目後にはB6マウスではTreg細胞の割合は減少し、Teff細胞の占める割合が多くなり、腫瘍に対して免疫応答が起こっていることが示唆された。一方、MUC1.TgマウスではTeff細胞の増加が有意に抑制され、結果としてB6マウスと比べて高いTreg/Teff比が保たれていた。このことから、MUC1.TgマウスではSL4-MUC1に対する免疫応答が抑制されていることが、腫瘍内T細胞亜集団の性質として示された。

第三部では、3.MUC1.TgマウスにはMUC1に対する末梢免疫寛容が存在する事が示された。上記の示した実験結果から、MUC1.Tgマウスでは腫瘍内でTeff細胞の増加が抑制されていることが明らかになった。しかし、MUC1.Tgマウスでは中枢性免疫寛容によってMUC1に反応することのできるT細胞の数が減少している可能性があるため、MUC1に対する免疫応答を末梢で抑制する末梢性免疫寛容が存在するかどうか、またTreg細胞がそれに関わっているかどうかは不明だった。そこでMUC1.TgマウスにMUC1特異的な末梢性免疫寛容が存在するのかどうかを明らかにするため、MUC1.Tgマウスをレシピエントとして、抗原特異的に活性化したT細胞と腫瘍細胞を混合して移植を行うことによって腫瘍特異的なT細胞の活性化を測定できるWinn assayを行った。B6マウスをMUC1 DNAワクチンで免疫することにより、MUC1特異的なT細胞を活性化させこれらの細胞を脾臓から調製し、MUC1を強制発現させたB16-F10メラノーマ細胞と混合し、ナイーブなB6マウスまたはMUC1.Tgマウスの皮下に移植した。B6マウスをレシピエントにした場合、MUC1特異的なT細胞の効果によって腫瘍は完全に拒絶されたが、MUC1.Tgマウスをレシピエントにした場合には、MUC1特異的なT細胞が存在するにも関わらず、腫瘍の増殖が認められ、全てのマウスは最終的に死亡した。このことから、MUC1.TgマウスにはMUC1特異的なT細胞による腫瘍細胞の増殖を抑制する効果を、末梢で抑制する機構が存在することが示された。

第四部では、MUC1.Tgマウス由来のTreg細胞はMUC1特異的にT細胞応答を抑制する事を明らかにした。MUC1.Tgマウスにおける、MUC1に対する末梢性免疫寛容による腫瘍細胞の増殖において、Treg細胞が重要な役割を果たしている可能性が考えられたので、MUC1.TgマウスのTreg細胞がMUC1特異的に免疫応答を抑制するかどうかを以下の方法で調べた。T細胞ハイブリドーマであるVF5細胞は抗原提示細胞によって提示されるMUC1ペプチドに反応してIL-2を産生するので、MUC1特異的T細胞活性化の指標となる。そこで、B6マウスまたはMUC1.Tgマウスから分離したCD4+CD25+Treg細胞を加え、IL-2産生の低下から免疫抑制能を評価した。コントロールとして加えたCD4+CD25-のナイーブT細胞はIL-2の産生を抑制しないのに対して、CD4+CD25+のTreg細胞を加えるとVF5細胞によるのIL-2産生はTreg細胞の細胞数依存的に抑制された。さらに、B6マウス由来のTreg細胞と比較してMUC1.Tgマウス由来のTreg細胞は、より強力にVF5細胞によるIL-2産生を抑制した。一方、MUC1と関係の無い卵白アルブミン(OVA)を感作させたB6マウスより単離した、OVA特異的CD4+T細胞(Tova)によりOVA特異的に産されるIL-2に対する抑制能は、B6マウスとMUC1.Tgマウス由来のTreg細胞の間で差が無かった。これらの結果から、MUC1.TgマウスのTreg細胞にはMUC1特異的なT細胞応答をMUC1特異的に抑制する細胞集団が含まれることが示された。

以上述べたように、学位申請者杉浦大祐はMUC1.TgマウスのMUC1に対する免疫寛容による抗腫瘍免疫抑制のメカニズムとして、末梢での免疫寛容が存在することを明らかにした。また、その機構に関与すると考えられるTreg細胞にはMUC1特異的に免疫応答を抑制する細胞集団が存在することを示した。T細胞レセプタートランスジェニックマウスを用いずに、抗原特異的なTreg細胞がナイーブなマウスで存在することを示した報告、またそのTreg細胞が抗原特異的に免疫応答を抑制するという報告は今までになかったので、免疫抑制の機構を理解する上で全く新しい知見が得られたと言える。このMUC1特異的Treg細胞はMUC1のどのようなペプチド配列を認識しているのか、またMUC1上の糖鎖構造が変化することによって、認識が変化するのかを明らかにすることが今後の課題である。本研究によって示されたMUC1特異的Treg細胞を減少させ、あるいは効果を減弱させることにより、MUC1.Tgマウスで特異的な免疫寛容を打破しMUC1を発現する癌細胞に対する免疫治療の効果を上昇させることが可能になると考えられる。従来から、Treg細胞は癌の免疫治療の効果を上昇させるための障壁であり、ターゲットであると考えられてきたが、Treg細胞を全身的に除去するような方法によって、過剰な免疫応答を抑制することができずに、自己免疫疾患が誘導されるといった、副作用が懸念されている。本研究で示されたような、抗原特異的なTreg細胞をターゲットにすることにより、このような副作用が軽減できる可能性があり、癌の免疫治療の新たな可能性を提示することができたと考えられる。以上の成果は免疫学及び腫瘍学に資するところが大きく、本研究を行った杉浦大祐は、博士(薬学)の学位を取得するにふさわしいと判断した。