序論

種子植物のほとんどは雄蕊と雌蕊を一つの花の中にもつ両性花植物であり、雌花と雄花が別々の個体につく雌雄異株植物は被子植物全体の6%に過ぎない。しかし、両性花植物から雌雄異株植物への進化は、科や属のレベルで独立に何回も起きている現象であり、被子植物全49 目中、7 割にあたる35 目に雌雄異株植物が存在する(Charlesworth 2002)。ヒロハノマンテマは、植物の雌雄異株性を研究するうえで、生殖器官である花が大きく観察しやすく、形態的に明瞭に識別可能な性染色体をもつなどの点から優れた材料である。その雌雄性は、Y 染色体の有無で決まっており、Y 染色体上には雌蕊抑制機能(GSF:Gynoecium Suppression Function)領域、雄蕊促進機能(SPF:Stamen-Promoting Function)領域と葯成熟機能(MFF: Male-Fertility Function)領域が存在する。それぞれの領域を欠失した個体は両性花あるいは無性花変異体となることが知られている(Farbos et al. 1999, Lardon et al. 1999)。

本研究では、ヒロハノマンテマの無性花突然変異体と両性花変異体を用いて、Y 染色体上に存在する性決定因子の欠失によって、花の各器官、特に雌蕊と雄蕊の形態変化がどのように起こるのかを明らかにした。さらに、無性花や両性花の雌蕊、雄蕊において、形態異常が起こる時期に発現する花器官形成遺伝子の発現解析を行い、雌蕊と雌蕊の形態異常に関わる遺伝子を明らかにしたいと考えた。この研究はヒロハノマンテマの性染色体欠失と、雌蕊や雄蕊の形態変化を遺伝子レベルで結びつけるための糸口となると考えられる。

結果と考察

1. 両性花突然変異体R025 の性染色体と花発達

1) R025 の両性花

ヒロハノマンテマ乾燥種子に炭素イオンビームを照射し、染色体部分欠失変異体を作出した。芽生え以降の生存率が80%となる、100 Gy-120 Gy 照射区から照射当代の両性花突然変異体R025 が単離された。R025 の成熟花は、10 本の成熟した雄蕊(st)に加えて、5 本の花柱と1 つの子房からなる成熟した雌蕊(g)をもっていた(図1)。野生型雌雄の花では発達初期には雄蕊原基と雌蕊原基の両方が分化し、その後2 つの発達段階で雌雄の差異が生じる。第1 段階は領域決定期のステージ5 で、雌の雌蕊領域(g)は、雄の雌蕊領域(g)より大きくなり、テーブル状になる。第2 段階は器官伸長期のステージ7 である。このとき、雌の雌蕊(g)には5 つの筒状の心皮(c)が現れるが、雄の雌蕊(g)は棒状に抑制され、心皮構造は見られない。同じくステージ7 で、雌の雄蕊(st)はステージ6 のまま変化しないが、雄の雄蕊(st)は葯と花糸に分離し、その後ステージ8 で伸長を開始する(図1)。R025 の花は、発達初期においてすべての花原基をもっていた。ステージ5 でR025の花の雌蕊領域(g)は、雌に似て、大きなテーブル状となり、その後ステージ7 において、5 つの心皮(c)を形成した。またR025 の雄蕊原基(st)は、ステージ7 で雄と同様に葯と花糸に分離し、その後伸長して、正常な形態の花粉をつけた(図1)。R025 の花では、葯における半葯の分化や、心皮における花柱の分化なども野生型と同時期に観察されており、本来抑制されるはずの性器官の発達により、他方の性器官の成熟が遅れることはなかった。

2) R025 のY 染色体

R025 個体には当初、一部野生型雄花への枝変わりが見られたことから、R025 はY 染色体を有すると考えられた。R025 の核型をAA+XY(A:常染色体)と仮定し、かけ合わせにより両性花化の原因となる変異の座乗染色体を解析した。R025(AA+XY)と野生型雌(AA+XX)の交配では、雌花個体と両性花個体が約1: 1 の割合で得られた。R025 どうしの自家交配では、得られた子孫の分離比は雌花:両性花が約1:2 となった。これらの子孫分離比と、雄花の子孫が得られなかったことから、両性花の原因となる変異はY染色体上にあることが示唆された。さらにマーカー解析により、R025 は確かにY 染色体特異的配列をもつことが確認された。

3) R025 の雌蕊発達

R025 はもともと雄であるが、領域決定期のステージ5 において雌に似て大きな雌蕊領域を生じる。これには花器官領域の形成に関わる遺伝子SlSTM1、SlSTM2(SHOOT MERISTEMLESS(STM)のホモログ)とSlCUC(CUP-SHAPED COTYLEDON(CUC)1、CUC2 のホモログ)が関与する可能性が考えられる。そこでステージ5 以前の花芽において、SlSTM1、SlSTM2(SlSTM)とSlCUC の発現パターンを調べた。ステージ2 のドーム状の花芽では、SlSTM は花芽中央部(予定雌蕊領域)で発現し、SlCUC は予定がく片領域とそれ以外の領域の境界で発現していた。ステージ3 になると、雄の予定雌蕊領域でSlCUC が検出され、同時にSlSTM 発現が消失した。一方、ステージ3 のR025 の予定雌蕊領域ではSlCUC は検出されずSlSTM の発現が保たれた。雄とR025 において、雌蕊発達の有無は予定雌蕊領域でのSlCUC 発現の有無と一致していた。R025 のもつ雌蕊発達に関わる変異は、花形成カスケードでSlCUC あるいはその上流に働いてSlSTM-SlCUC 遺伝子発現パターンを変化させることが示唆された。

2. 無性花突然変異体K034 の性染色体と花発達

1) K034 の無性花と雌様花

純系K 系統(柏市系統)から自然発生した突然変異体K034 は、無性花と不完全な雌花(雌様花)をつけた。無性花は成熟した雄蕊と成熟した雌蕊のどちらももっておらず、雌様花は、通常5 本あるはずの心皮が1から3 本に減少した不完全な雌蕊(g)をもっていた(図2)。K034 の2 種類の花の混在がキメラによるものである可能性を考え、K034 の花つき分布を調べた。K034 につくほとんどの花(90%)は無性花であり、残り(10%)は雌様花であった。この傾向は、挿し木個体やK034 の子孫個体においても変わらなかったことからK034 のキメラの可能性は除外された。

K034 の2 種類の花における形態異常を走査型電子顕微鏡により観察した。K034 の無性花と雌様花の雌蕊領域(g)は、領域決定期のステージ5 において、どちらも雄に似て小ぶりだった。ステージ7 には、無性花の雌蕊(g)は棒状に抑制され、雌様花の雌蕊(g)には1 から3 本の心皮(c)が出現した。K034 の無性花と雌様花の雄蕊(st)は、雄の雄蕊と同様にステージ7 で葯と花糸に分離したが、ステージ8 において発育不全を起こした(図2)。ステージ10 で、雌の雄蕊は退化するが、K034 の花の雄蕊は退化することなくそのままの形を保った。

2) K034 のY 染色体

K034 の花の形態異常が性染色体に因るものかどうか調べるため、Y 染色体上のSTS マーカーを用いてK034 におけるY 染色体の有無を調べた。STS マーカー12 個のうち7 つの存在は確認されたため、K034 はY 染色体特異的な領域をもつことがわかった。しかしK034 はY 染色体p 腕上の5 つのSTS マーカーを欠失していた。ヒロハノマンテマのY 染色体p 腕上には、雌蕊抑制(GSF)領域と雄蕊促進(SPF)領域がある。欠失マーカー5 つのうち4 つはGSF 領域にあり、1 つ(ScQ14 マーカー)はSPF 領域にあるため、K034 のY 染色体はGSF とSPF という2 つの領域の一部を欠失することがわかった。K034 ではScQ14 マーカーを含むSPF 領域を欠失するため雄蕊伸長遺伝子が活性化せず無性花をつけると考えられる。また、GSF 領域の一部を失ったために雌蕊伸長遺伝子が時折活性化する可能性がある。

3) K034 の核型と子孫解析

K034 のY 染色体に注目しK034 の核型と子孫解析を行った。K034 には通常と同じ22 対の常染色体に加えて、2 本のX 染色体と1 本の、形態異常をもつY染色体(Yd)が観察された。K034 のY 染色体(Yd)はマーカー解析から予想されたp 腕の大規模欠失に加えて、減数分裂時にX 染色体と対合するPAR 領域を失っている可能性が高いこともわかった。ヒロハノマンテマでは、XXY、XXXY 個体がいずれも正常雄個体となるため(Westergaard 1940)、K034 の花の形態異常の原因は、余分なX 染色体ではなく、形態異常をもつYd 染色体にあると考えられる。K034 雌様花と野生型雄をかけ合わせると雄、雌、K034 タイプ(無性花と雌様花)の子孫がそれぞれ12、14、6 個体得られた。K034 タイプの子孫6 個体の核型はすべてK034 と同様にXXYd であった。K034 では、減数分裂時に大規模欠失をもつYd ではなく、2 本のX 染色体が対合する可能性が高く、このためにK034 のYd 染色体が後代に安定して伝わるのではないかと考えられる。

4) K034 の雄蕊発達と雌蕊発達

K034 の雌蕊と雄蕊はステージ7 以降の器官伸長期に形態異常を起こす。器官伸長期に雄蕊と雌蕊が発達するメカニズムはABC クラス遺伝子が担っていると考えられる。そこで、雌蕊(g)と雄蕊(st)の器官形成に関わるSLM1(C クラス遺伝子AGAMOUS ホモログ)と、雄蕊(st)と花弁(p)の器官形成に関わるSLM2(B クラス遺伝子PISTILLATA ホモログ)の発現解析を行った。

K034 の無性花と雌様花の雄蕊原基(st)では、ステージ7 まで、SLM1 とSLM2 はともに発現していた。しかし、ステージ8 になると、雄蕊原基(st)でのSLM1 とSLM2 の発現はともに消失した。野生型雄花の発達する雄蕊(st)ではステージ8 以降もSLM1 とSLM2 の発現が継続することから、ステージ8 にK034 の無性花と雌様花の雄蕊が発育不全を起こすのは、雄蕊形成に必要なSLM1 とSLM2 の発現が消失するからであると考えられる。K034 の雄蕊発達に関わる変異は、花形成カスケードのABC クラス遺伝子の上流に働き、雄蕊でのSLM1 とSLM2 発現を消失させ、その結果、K034 の雄蕊が発育不全を起こすものと考えられる。

一方、K034 の花の雌蕊原基(g)は、ステージ7 において、心皮をもつもの(雌様花)と心皮をもたないもの(無性花)にわかれる。このときSLM2 はどちらの雌蕊原基(g)でも発現せず、SLM1 はどちらの雌蕊原基(g)でも発現していた。そこで、ステージ7 より前のK034 の花において、雌蕊領域形成に関わるSlSTM とSlCUC の発現解析を行った。K034 の花には、ステージ3 の雌蕊領域でSlSTM 発現が保たれるもの(14.3%)とSlCUC が検出されるもの(85.7%)があり、中間型の発現パターンは観察されなかった。この割合は、K034 における雌様花の頻度(約10%)とほぼ一致したことから、K034 で、SlSTM-SlCUCの発現パターンがその後の雌蕊抑制パターンと対応すると考えられた。K034 の雌蕊抑制に関する変異はSlCUC とSlSTM の上流で働いており、その変異によりステージ3 の花芽におけるSlSTM-SlCUC の発現パターンが一定の割合で切り替わる。その結果、K034 の雌蕊抑制が約10%の割合で解除されて雌様花となると考えられる。

結論

雌雄異株植物ヒロハノマンテマの両性花変異体(R025)と無性花変異体(K034)を用いて、形態的解析により性染色体上の性決定因子と花の形態異常との関係を明らかにし、それに関わる分子メカニズムの一端を遺伝子発現解析により明らかにした。K034 の雄蕊促進(SPF)に関する変異は、Y 染色体上のScQ14 マーカー近傍にあり、SLM1 とSLM2 あるいはその上流の遺伝子に働きかけ、ステージ8 の花芽において、雄蕊形成に必要なSLM1 とSLM2 の雄蕊原基での発現を消失させる。その結果、K034 の雄蕊は発育不全を起こすと考えられる。

R025 はもともと雄だが両性花をつけるため、雌蕊抑制(GSF)に関する変異をもつと考えられる。R025の雌蕊領域は、領域決定期のステージ5の花芽において、雌と同様に大きくなり、その後、雌がもつような5 つの心皮を形成する。そのため、R025 の雌蕊抑制に関する変異は、雌蕊抑制を完全に解除するものだと考えられる。一方、K034 もまた、もともと雄だが時折不完全な雌花をつけるため、雌蕊抑制(GSF)に関する変異をもつと考えられる。K034 の雌蕊領域は雄に似て小さいが、その後、約10%の割合で小さな雌蕊領域に心皮が形成され、雌様花となる。K034 の雌蕊抑制に関する変異は、一部の花において限定的に雌蕊抑制を解除するため、R025 の雌蕊抑制に関する変異とは異なる性質のものである可能性がある。しかしながら、R025 とK034 の雌蕊抑制に関する変異は、どちらもY 染色体上にある可能性が高く、SlCUC あるいはその上流の遺伝子に働きかけて、ステージ3 の花芽において、SlSTMとSlCUC の遺伝子発現パターンを変化させる。その結果、R025 やK034 における雌蕊の形態変化が起こると考えられる。

図2.K034の無性花と雌様花.数字はステージ. A:K034 無性花. 雌蕊原基(g)と雄蕊原基(st)の両方が発達しない. FL:K034 雌様花.1-3 の心皮(c)をもつ雌蕊原基(g)が発達する.

図3.R025 とK034 の性染色体と花発達. R025 はY 染色体上の雌蕊抑制因子GSF に変異をもつため、ステージ3 の雌蕊でのSlSTM 発現が保たれて、成熟雌蕊をもつ両性花となる. K034 はY 染色体上の雄蕊促進因子SPF を欠くため、雄蕊形成に必要なSLM1 とSLM2 の雄蕊原基での発現が消失し、雄蕊が伸長しない無性花となる. K034 はGSF 領域の一部も欠失するため、雌蕊の発達抑制が一部解除され、不完全な雌蕊ができる.

本論文は3章からなり、第1章は両性花変異体R025の解析、第2章は無性花変異体K034の解析、第3章は無性花変異体K034につく不完全な雌花について述べられている。

雌雄異株植物ヒロハノマンテマは、植物の雌雄異株性を研究するうえで、生殖器官である花が大きく観察しやすく、形態的に明瞭に識別可能な性染色体をもつなどの点から優れた材料である。その雌雄性は、Y染色体の有無で決まっており、Y染色体上には雌蕊抑制機能領域、雄蕊促進機能領域と葯成熟機能領域が存在する。それぞれの領域を欠失した個体は両性花あるいは無性花変異体となることが知られている。

本研究では、ヒロハノマンテマの無性花突然変異体と両性花変異体を用いて、Y染色体上に存在する性決定因子の欠失によって、花の各器官、特に雌蕊と雄蕊の形態変化がどのように起こるのかを明らかにした。さらに、無性花や両性花の雌蕊、雄蕊において、形態異常が起こる時期に発現する花器官形成遺伝子の発現解析を行い、雌蕊と雌蕊の形態異常に関わる遺伝子を明らかにしたいと考えた。この研究はヒロハノマンテマの性染色体欠失と、雌蕊や雄蕊の形態変化を遺伝子レベルで結びつけるための糸口となると考えられる。

第1章では両性花変異体R025の解析を行った。R025はもともと雄だが両性花をつけるため、雌蕊抑制(GSF)に関する変異をもつと考えられる。R025の雌蕊領域は、領域決定期のステージ5の花芽において、雌と同様に大きくなり、その後、雌がもつような5つの心皮を形成する。そのため、R025の雌蕊抑制に関する変異は、雌蕊抑制を完全に解除するものだと考えられる。そこで雌蕊発達に関わるSlSTMとSlCUCの遺伝子発現パターンを調べたところ、R025の雌蕊は野生型雌に似た発現パターンを示しており、これはSlSTMとSlCUCの遺伝子発現パターンがヒロハノマンテマの雌蕊における性決定に関わることを示唆している。

第2章では無性花変異体K034の解析を行った。K034の雄蕊は器官伸長期において発育不全を起こす。K034の雄蕊促進(SPF)に関する変異は、Y染色体上のScQ14マーカー近傍にあり、SLM1とSLM2あるいはその上流の遺伝子に働きかけ、ステージ8の花芽において、雄蕊形成に必要なSLM1とSLM2の雄蕊原基での発現を消失させる。その結果、K034の雄蕊は発育不全を起こすと考えられた。一方、K034の雌蕊は、時折不完全な雌花となるため、K034は雌蕊抑制(GSF)に関する変異ももつと考えられる。

K034の雌蕊領域は雄に似て小さいが、その後、約10%の割合で小さな雌蕊領域に心皮が形成され、雌様花となる。K034の雌蕊抑制に関する変異は、一部の花において限定的に雌蕊抑制を解除するため、R025の雌蕊抑制に関する変異とは異なる性質のものである可能性が考えられる。

第3章では、K034個体に見られる2種類の雌蕊に注目した。その結果、K034の雌蕊抑制に関する変異は、Y染色体上にある可能性が高く、SlCUCあるいはその上流の遺伝子に働きかけて、ステージ3の花芽において、SlSTMとSlCUCの遺伝子発現パターンを変化させることがわかった。そのため、K034における雌蕊の形態変化が起こると考えられた。この変化は野生型雌雄において起こる雌蕊の性決定システムと同等であると考えられるため、K034の雌蕊はエピジェネティックな形態変化を起こすことが明らかとなった。

なお、本論文第1章は、山中香、河野重行との共同研究、第2章は、天内康人、石井公太郎、西原潔、風間裕介、内田和歌奈、河野重行との共同研究、第3章は、山中香、河野重行との共同研究であるが、論文提出者が主体となって分析及び検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

したがって、博士(生命科学)の学位を授与できると認める。