1.はじめに

近年,蛋白質立体構造データベース(PDB)に登録された構造の数は増加しつつある.既知の立体構造の解析により得られる配列構造相関の知識は,蛋白質の立体構造を理解するために重要であり,またアミノ酸配列から蛋白質の立体構造を予測する際にも基礎となる.

一方,蛋白質のサイズ,すなわち残基数は,それが増加すると蛋白質において表面で溶媒と接触できる領域が相対的に減少し,同時に,蛋白質のほとんどの構造要素の数が増加するため、蛋白質の他の特徴に大きく影響を与える要素である.

そこで,本研究では計算科学的手法を用いて,蛋白質のサイズという観点から配列構造相関に関する二つの研究を行なった.第一の研究では,蛋白質のサイズのアミノ酸組成に及ぼす影響を解析した.第二の研究では,立体構造の蛋白質らしさを表す新しい指標の開発を行なった.この指標は,アミノ酸配列異なる蛋白質問では直接比較することが困難であった従来の指標を、配列の情報,特にサイズの影響を考慮して規格化することで、機械学習によって統合したものである.これらの二つの研究を通して,蛋白質のサイズは蛋白質の配列構造相関を考える上で欠かせない特徴であることを明らかにした.

2. 蛋白質のサイズがそのアミノ酸組成へ与える影響

蛋白質中のアミノ酸残基がおかれる環境は蛋白質のサイズによって影響を受ける.図1はサイズが異なる蛋白質を表面の残基を黒,内部の残基を灰色で表示したものである.この図が示すように蛋白質のサイズが増加すると溶媒に露出する表面の残基の比率が減少する.一般に親水性残基は表面に露出する傾向が強いが,蛋白質サイズの増加に伴い、表面の比率が減少すると、これらの残基はその出現頻度を減少させるか、蛋白質コア(内部)に埋もれる必要が生じる.

過去の研究では蛋白質サイズの増加に伴い,コアに埋もれる親水性残基が増加することが報告されている.また,親水性残基全体としては出現頻度に大きな変化は無いが、各アミノ酸種の出現頻度を個別に評価すると,蛋白質サイズの増加とともに親水性残基のうちLys, Glu, Argが減少し,Aspが増加するという報告がなされている.これらの知見は興味深いものであるが、その解析手法には、相関を見る際、直接的に影響を与えると考えられる表面の比率ではなく、蛋白質のサイズをそのまま用いているといった問題があり、また、何故親水性残基の中で出現頻度が減少するものとしないものが存在するのかといった点は明らかにされていない.

そこで本研究では,親水性残基の出現頻度にサイズよりも直接相関すると考えられる指標として,表面積体積比(Surface-to-Volume Ratio, SVR)を蛋白質の溶媒接触表面積と体積の比として定義し,表面の比率の変化がアミノ酸の出現頻度に対してどのような影響を与えるかを解析した.

解析には蛋白質の構造ドメインを定義したデータベースSCOP(Structural Classification of Proteins)より配列冗長性を除いた7309の代表構造を用いた,その結果,親水性残基のうちでLys, Glu,Arg, Glnは,この順番で強く,表面の比率の減少(図2)およびサイズの増加とともにその出現頻度が減少した.また、蛋白質のサイズと表面の比率のどちらが残基出現頻度と直接の相関を持つか偏相関を用いて解析したところ,表面の比率の方が主な要因であることを見いだした.

一方Asp, Asn(Asx)は親水性残基でありながら表面の比率の減少に伴い出現頻度が増加した.これらの残基は似たアミノ酸だと考えられる事が多いGlu, Gln(Glx)とは異なり、近傍の主鎖と水素結合を形成しやすいことが知られている。そのため、溶媒に露出していなくとも安定に存在することが可能であり、表面の比率が減少したときに内部に埋もれることができると考えられる.

これらの結果から,蛋白質のサイズという構造的特徴の変化が表面の比率の変化を介して,アミノ酸組成という配列の特徴に影響を与えることが示された.これは通常認識されているアミノ酸配列が構造を決定するのとは逆方向の配列構造相関である.

次に,前述の4つの親水性残基について,表面の比率が減少したとき,出現頻度の減少だけでなく蛋白質内部への埋もれの増加が起きているかを調べた。図3はSVR毎の蛋白質全体.での出現頻度とコア(蛋白質内部)での出現頻度を示したものである.SVRが減少するとデータ点が左上に移動する傾向を示しており,表面の比率の減少により出現頻度が減少するとともにコアへの埋もれの増加も同時に生じることがわかった.さらに,SVRが0.3A(-1)付近に変曲点があり,それを下回ると,埋もれの増加の効果が強く出る(傾きが急になる)ことを観察した.サイズで言うと,親水性残基の蛋白質内部への埋もれは約130残基より大きくなってから急激に増加する事を意味している.

3. 立体構造の蛋白質らしさの評価方法の開発

蛋白質の立体構造予測においては生成された立体構造モデルが本当に天然の蛋白質らしい構造をとっているかを評価することが非常に重要である.そのため、様々な立体構造評価手法が提案されてきたが、原子ペアを単位としてその原子間距離も考慮した統計的な手法による構造評価法は精度の点で優れており、立体構造予測のモデル評価などで広く利用されている。しかし,立体構造の予測コンテストCASPの結果などを見ると,現在の評価手法の精度は未だ不十分なものであり,より高精度の構造評価手法が求められている。

一般に統計的な手法では,構造の蛋白質らしさは,蛋白質天然構造のデータベースにおいて,ある構造要素が見られた観測数と,参照状態と呼ばれる,蛋白質らしさがなくなった仮想的な状態においてその要素が期待される数との比の対数として表される.つまり,期待されるよりもより頻繁に天然構造に現れる構造要素は蛋白質らしく,そうでない構造要素は蛋白質らしくないと判断される.現在では様々な原子ペアを単位とした統計に基づく構造評価手法が提唱されているが,これらの問の違いは参照状態の定義の仕方にある.

本研究ではまず,これらの参照状態の異なる原子ペア単位の構造評価方法の性能を比較した.このために,2006年に行なわれたCASP7における122ドメインについてのおのおの約200~400の予測モデル構造とその天然構造を用いて,「天然構造を予測モデル構造から識別する能力」および「予測モデル構造を天然構造との構造類似性に従って評価付けする能力」について評価を行なった.その結果,これらの方法の中で全ての性能評価項目において優れているものは存在せず、常に良い結果が得られる参照状態の定義がある訳ではないことを明らかにした.この結果から,本研究ではこれらの既存の構造評価方法を組み合わせることで,個々のものより改良された蛋白質らしさの評価手法を作ることを試みた.

複数の蛋白質らしさのスコアを組み合わせるためには,各々のスコアが同じ値であれば常に同程度の天然構造らしさを意味することが望まれる.しかし,従来の蛋白質らしさのスコアはその絶対値が対象となる蛋白質に含まれる原子ペア数に依存する性質がある.また,図4が示すように蛋白質のサイズが増加すると原子ペア数も増加するため,これらのスコアの絶対値は対象となる蛋白質サイズの増加に強く影響されるという問題があった.

そこで私は,既存の蛋白質らしさのスコアをサイズとそのアミノ酸配列によって補正する方法を考案した.まず,既知の天然構造のデータベースより対象の蛋白質と同じようなサイズの蛋白質が,どれだけの数の原子ペアを持つかを推定した.これらの原子ペアが天然構造にみられるようなものである時のスコアを1,参照状態でみられるような原子ペアである時のスコアを0として,蛋白質らしさのスコアを規格化することによって補正を行った.

この補正の効果を検証するため,CASP7における天然構造とモデル構造について,補正後のスコア(横軸)と天然構造との立体構造の類似度GDT(縦軸)をプロットした(図5).ここで,GDTは[0,1]の値をとり,天然構造に近いほど1に近づく指標である.補正後のスコアはどのようなアミノ酸配列の構造に対してもほぼ0と1の間にあり,天然構造とのGDTとよく相関することがわかった。また,天然構造とのGDTが1である点は天然構造自身であるので,これらの点の補正後のスコアは理想的には1となるべきであるが,実際に0.8-1.2と1に近いスコアをとっている事もわかった.また,構造によっては補正後のスコアが[0,1]の範囲を越えているものもあるがこれらは少数であった.

この補正スコアを入力に,構造の天然構造との予測GDTを出力とするような新たなスコアを機械学習により作成した.このスコアはCASP7のモデル構造セットをによる評価で,モデル構造の評価付けと天然構造の識別の両者において,個々のスコアからの改善がみられた.

4. まとめ

本研究では,蛋白質のサイズの増加に伴う表面積の減少という構造的変化が親水性残基の出現頻度を減少させることを示した.このことは、アミノ酸配列は蛋白質の構造を決定するが,それと同時に蛋白質のアミノ酸配列はその構造によっても制約を受けるという逆方向の影響もあることを意味し,蛋白質にとってのサイズの重要性を物語る知見である.

また,原子ペアを単位とした蛋白質らしさのスコアをサイズを考慮してアミノ酸配列により補正し,天然構造との近さというアミノ酸配列によらないスコアを考案した.このような規格化は既存のスコアを組み合わせてより改良された構造評価方法を構築することを容易とするため,蛋白質の立体構造予測への応用につなげることが期待できる。

図1 蛋白質のサイズと表面の比率

図2 表面の比率と親水性残基の頻度

図3 表面の比率の減少に伴う親水性残基の頻度の減少と埋もれの増加

図4 蛋白質サイズ(残基数)ごとの原子ペアの距離分布

図5 補正後のスコアと天然構造とのGDT

本研究は2章からなり、第1章は蛋白質サイズがアミノ酸組成に与える影響、第2章は蛋白質立体構造モデル評価方法の開発について述べられている。

第1章は蛋白質が大きくなったらどのような変化が起こるだろうかという基本的な問いに答えを出す研究である。蛋白質サイズ(アミノ酸残基数)が増加すると、その表面の領域が蛋白質全体に占める比率は低下する。親水性残基は表面を好む傾向が高いので、蛋白質サイズの変化による表面領域の減少により、登場頻度の変化が期待される。本研究では、表面の比率の減少に伴い親水性残基の出現頻度、内部に埋もれる頻度の変化、および出現頻度と埋もれの頻度の相関を解析している。

このためにまず、蛋白質における表面の比率をその溶媒接触表面積と体積の比(Surface-to-Volume Ratio、以下SVRと呼ぶ)を定義し、SVRの変化とともにアミノ酸組成がどの ように変化するかを観察した。従来は蛋白質サイズの増加をアミノ酸残基数で見積もっていたために、表面の比率が減少する効果を間接的にしか観察出来ていなかったが、本研究ではSVRを変数として利用し、残基組成とSVRの偏相関(残基数固定条件)を計算することで、直接的な影響を定量的に見積もることが出来ている。

その結果、蛋白質のサイズ(SVR)が増加したときにLys、Glu、Arg、Glnの4つの親水性残基の出現頻度が減少するが、それは残基数の影響ではなく表面の比率が減少する結果であること、および、親水性残基のうちでも近傍の主鎖と水素結合を作りやすく内部に埋もれやすい残基は表面のSVRが減少しても頻度が減少しないどころか増加しうる事を明らかにした。

また、表面の比率が低下すると親水性残基は頻度を減らすだけでなく、より多く内部に埋もれることでも対応できるが、本研究では埋もれ度とSVRの相関を観察することで、SVRが小さい蛋白質ほど、出現頻度の減少よりも急激に埋もれる割合が上がる事を見いだした。また、埋もれた親水性残基の比率が増加しても、各親水性残基当たり埋もれるのに必要な水素結合、塩橋などの極性相互作用はほとんど変化しないことから、親水性残基の埋もれの増加は、表面の比率が減るという消極的な原因だけでなく、蛋白質内部においてより多くの極性相互作用を提供することが可能になった結果でもあることを示している。

第2章では蛋白質立体構造予測において不可欠な構造モデル評価方法の開発という実用的な研究を報告し、原子ペアに対する統計ポテンシャルの改善を行っている。

まず、さまざまな特徴を持った7つのポテンシャルを作成し、それらの特徴が性能に及ぼす影響を評価している。特徴としては、疎水性効果と蛋白質のコンパクトさを評価する重みという観点から分類し、性能に関しては、モデル構造を天然構造との構造類似性にしたがって正しく並べる能力および天然構造をモデル構造から識別する能力によって評価を行っている。

その結果、「疎水性効果を強く評価することは良いモデルと悪いモデルの間の違いを際立たせるが、天然構造とモデルの間の違いを識別能を下げること」および「コンパクトさを評価することは天然構造に近い構造モデルの評価には適しているが、モデル構造が天然構造とは大きく外れているようなときには悪い影響を与えることもある」ということを明らかにしている。以上の結果から、ポテンシャルの性能は、性能評価の指標及びモデルの性質に強く依存し、どのような状況でも高い性能を示すポテンシャルないという結論を得ている。

この結果をふまえて、第2章の後半では個々のポテンシャルにより得られた評価値をSupport Vector Regressionによって統合することで、より精度の高いモデル評価方法を開発した。 このようにして開発されたポテンシャルは、個々のポテンシャルや代表的な既存の原子ペアポテンシャル及び残基単位のポテンシャルよりも、モデル間の区別や天然構造の識別において優れた性能を持つ事を示した。

以上の二つの研究を通じて本論文では、蛋白質の配列構造相関における基礎的な知識の蓄積と実用面での応用について貢献したものである。

審査会では、「進化的な配列の変化と、大きさが配列に及ぼす影響の関係の解析がまだ不十分である」という弱点も指摘されたが、「実験家の立場から見ても、特に前半は、蛋白質の立体構造とアミノ酸配列の関係に関して新しい視点を与えるおもしろい研究である」とか「後半も地味ではあるが、専門家にとっては非常に興味深く、今後多くの引用が期待される良い仕事である」などのポジティブな評価を得た。

なお、本論文は、木下賢吾、石田貴士との共同研究であるが、論文提出者が主体となって分析及び検証を行ったもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。

したがって、博士(生命科学)の学位を授与できると認める。