Subseafloor environment is the largest known sink of methane on Earth, wheremost of the methane from deep sources is biologically oxidized by anaerobicmethanotrophic archaea (ANME). The process to anaerobic oxidation of methane(AOM) is not fully understood that sulfate acts as the final electron acceptor accordingto the net reaction: CH4 + SO42- → HCO3- + HS- + H2O. It is estimated that AOM inanoxic sediments eliminates >80% of the methane flux from the seafloor. Therefore,AOM plays a significant role not only for the biogeochemical carbon cycle in marinesediments but also for and global climate change.

ANMEs are classified into 3 groups (ANME-1, 2, 3) depending on theirphylogenetic affiliations. They have been found in global methane-seep environments and often reported as major microbial components. As they have not been cultivatedyet, we have little knowledge about their optimum conditions for the growth and energygain in natural environments, e.g. temperature, pH, salinity, and concentration ofmethane and sulfate. Therefore, it remains unclear what environmental factors controltheir preferential habitats. In this study, distribution and diversity of ANMEs inhydrothermal sediment and methane-seep field were investigated by using molecularbiological methods in order to clarify their ecological niche, environmental limitation oftheir habitable zone, and regulation factors on AOM activities.

In CO2-vented environment at Yonaguni Knoll IV hydrothermal field in theOkinawa Trough, the upper part of liquid CO2/CO2-hydrate bearing sedimentsrepresented acidic pH down to 4.5. The in vitro activity measurement of thesesediments showed that pH optimum of methane-fueled sulfate reduction was lower thanpreviously reported. Both microscopic observation and reverse transcription PCRanalysis of 16S rRNA fragments confirmed the co-occurrence of ANME-2 andDesulfosarcina/Desulfococcus branch of sulfate reducer. In contrast to the active anddiverse microbial population in surface sediments, microbial community in deepersediments represented drastically low abundance and sulfate reduction rate. Theseresults indicated that metabolically active and acidophilic microorganisms includingANME were mostly restricted in the upper part of the sediment possibly because ofchemical property of liquid CO2 or thermodynamic and kinetic constraints other thanpH.

The diversity and distribution of ANMEs were investigated in methane hydrate field off Joetsu in the Japan Sea. The sequence analysis of 16S rRNA genes showedthe predominant population of ANME-1 and ANME-2 in the sediment cores, but theirspatial distribution and abundance were found to be distinct. Quantitative PCRanalysis of methyl-coenzyme M reductase gene (mcrA) showed that the members ofANME-1 predominated the sediments containing low sulfate concentrations, evenbelow the sulfate-methane interface, indicating that they physiologically prefer the lowlevel of sulfate, while ANME-2 inhabit shallow sediments containing relatively highconcentrations of sulfate. Thus, the distributions of the ANMEs could be regulated bythe adaptability of sulfate in the environments. The dominance of ANME-1 in deeppart of the sediment was supported by the fact that net AOM reaction in low-sulfatesediment was thermodynamically and kinetically favorable. However, AOM isconsidered to proceed without direct coupling with sulfate reduction, because not cellaggregates but single cells were observed under the microscope. Consideringthermodynamic energy obtained by sulfate-independent methane oxidation, acetate canbe a likely candidate for mediator between AOM and sulfate reduction.

The adaptations of ANMEs to a wide range of variation in pH and sulfateconcentration were found. Possible AOM reactions are also discussed taking intoaccount the distribution of ANMEs, geochemical profile, and free energy yields in theenvironment. These results suggested the wide range of habitable environment ofANMEs and indicated a much more important role in biogeochemical cycles of carbonthan previously assumed.

本論文は5章からなる。第1章はイントロダクションであり、嫌気環境下において硫酸還元菌とペアでメタン酸化を行う嫌気的メタン酸化古細菌(AME)に関するこれまでの研究がレビューされ、地球上の炭素循環に占める研究の意義が簡潔にまとめられている。

第2章では研究対象の1つである第四与那国海丘熱水活動域の特徴、海洋調査の概要、微生物学的な解析手法、および得られた結果について詳しく議論されている。ここの熱水域は、熱水から供給される高濃度のCO2により酸性環境下にあるものの、堆積物試料からRNA分子を抽出し分子系統学的解析を行ったところ、嫌気的メタン酸化活性が検出され、酸性環境に適応したANME-2と硫酸還元菌が存在していることを明らかにした。これは従来の微生物系統学的研究の枠を越えて、実際にそこで起こっている代謝に注目した研究として特筆に値する。ここで、ANME-2はANME-1とともに州MEの中で卓越するグループである。

第3章では、もう1つの研究対象である日本海上越沖のメタン湧水域において、堆積物コア中のANME-1と-2の鉛直分布と間隙水の化学分析結果とを比較している。その結果、前者は硫酸塩が枯渇した環境に、後者は硫酸塩に富む環境に優占することが明らかになった。海洋環境における嫌気的メタン酸化は硫酸還元と密接にリンクしており、反応式では硫酸がメタンを酸化し、重炭酸と硫化水素が生成すると表現される。ところが、今回の詳細は研究により、硫酸イオンが殆ど存在しない還元的環境にANME-1が多産するという予想しなかった結果が明らかにされた。ANME-1の活性に硫酸イオンは必要ないのか、どのような反応と共役するのか、また観察されたANME-1は本当にメタン酸化を行なっているのかなど、間隙水組成の深度プロファイルと対比させながらANME-1とANME-2の分布と活性を調べた結果、微生物の役割について重要な課題が抽出された。

第4章では、上記の微生物生態学的な結果を説明するために、間隙水中の反応基質濃度や環境因子などのデータを基に、化学合成に用いられる代謝反応について化学熱力学的検討を加えている。その結果、第四与那国海丘ではpHではなく、硫酸塩濃度の減少に伴う化学エネルギー上の制約がANMEの分布を規制している可能性が明らかになった。

第5章では上記の結果に基づいて包括的な議論がなされている。ANME-1による嫌気的メタン酸化では、その過程で硫酸還元を利用できないが、反応速度論的計算から、メタンから酢酸が生成する反応、もしくは嫌気的メタン酸化の逆反応が進みメタン生成が起こっている可能性を示唆した。このように、本研究により、ANMEの生息限界はこれまでの知見から予想されるよりもはるかに広いことが明らかとなった。

これは、微生物生態と地球化学の複合的な情報を組み合わせることによって初めて可能になったことで、ANMEの代謝戦略について新たな知見を与えるものであるばかりでなく、地球発達史の中で州MEが炭素の地球化学的物質循環にどのような影響を与えて来たのかを知る上でも、重要な指針を与えるものである。

なお、本論文第3章は蛭田明宏との共同研究であるが、論文提出者が主体となって分析および検証を行ったもので、論文提出者の寄与が充分であると判断する。

したがって、博士(理学)の学位を授与できると認める。