Post-Golgi organelles play fundamental roles in various plant functions of higher order, where RABs and SNAREs play crucial regulatory roles in membrane tethering and fusion. Each organism has distinct set of RAB and SNAREs, and each molecule is expected to regulate a specific transport pathway. This suggests that plant unique RABs and SNAREs regulate specialized membrane traffic pathways to plants.

Arabidopsis thaliana has two types of RAB5 members, conventional RAB5 and plant unique ARA6. Distinct subcellular localization of ARA6 from conventional RAB5 suggested functional differentiation between these two RAB5 groups, but their precise functions remained unknown.

On the other hand, plant VAMP7-like R-SNAREs are diversified to formation in different post-Golgi trafficking pathways. VAMP727 is characterized by an insertion of 20 amino acids in its longin domain. VAMP727 homologs are conserved only in plants, and its molecular function of VAMP727 was unclear.

To gain insight into the plant post-Golgi trafficking pathways, I first studied post-Golgi SNARE complex formation with a special focus on VAMP7-like R-SANREs. By genetic, bioimaging and biochemical analyses, I revealed that VAMP727 forms a SANRE complex with VAM3, VTI11, and SYP51 on a subpopulation of PVCs closely associated with the vacuolar membrane. On the other hands, VAMP71, which localized on the vacuolar membrane, also formed a SNARE complex with VAM3, VTI11 and SYP51. These results indicated that two different SNARE complexes are involved in vacuolar membrane fusion. rab7 mutants showed similar defect to vamp71 mutants, which suggested that RAB7 and VAMP71 could regulate the same membrane fusion event.

I also found that VAMP727 forms a complex with PEN1, a Qa-SNARE localized on the plasma membrane (PM), on the punctate domains near the PM through coimmunoprecipitation and bioimaging analyses. The amount of this SNARE complex was reduced in ara6 mutant, and ARA6 also colocalized with VAMP727 and PEN1 on the PM. These results indicate that ARA6 and VAMP727 coordinately act on the plant unique membrane traffic pathway from the endosome to the PM, which is distinct from known secretory pathway. Physcomitrella patens ARA6 and an ARA6-like protein of Toxoplasma gondii also localized on the PM, which could indicate that ancestral ARA6 also regulated transport to the PM.

本論文はイントロダクション,4章からなる主編,ディスカッションからなる.イントロダクションでは,小胞輸送におけるRABとSNAREの機能について,また,既知の植物の小胞輸送制御因子についての概論が述べられている.第1章では,植物固有のSNAREであるVAMP727についての機能解析について述べられており,VAMP727が液胞膜に局在するSNAREと複合体を形成し,エンドソームから液胞への輸送経路において機能していることが示されている.第2章では,VAMP71とRAB7を中心とした液胞における膜融合制御について述べられている.第3章では,植物固有のRABであるARA6の機能解析について述べられており,シロイヌナズナのARA6がVAMP727を介してエンドソームから細胞膜への輸送制御を行っていることが明らかにされている.第4章では,シロイヌナズナ以外の生物におけるARA6様蛋白質の機能・局在解析について述べられており,この解析から複数の生物のARA6様蛋白質もシロイヌナズナ同様細胞膜への輸送経路において機能していることが示唆されている.

本論文は,膜融合の実行因子であるSNAREに関して,植物内でどのような複合体を形成し,どのオルガネラで膜融合を実行しているのかを詳細に明らかにした,これまでに例のないものであり,非常に高い評価を受けるべきものである.

また,これまでその機能が全く明らかになっていなかった植物固有のRAB5ホモログ,ARA6について解析し,ARA6が同じく植物固有のSNAREであるVAMP727を介してエンドソームから細胞膜への輸送を制御することを明らかにしている.この発見は,今まで植物では実在が示されていなかったエンドソームから細胞膜への輸送経路を実証したものであり,高く評価できる.同時に,植物固有の膜交通制御因子を獲得することにより,植物が新たな細胞内膜交通経路を獲得したことをも証明しており,進化的観点からも極めて価値が高い.さらに,本論文では,植物においてRABがSNAREを介して膜融合を制御していることの証明に,世界で初めて成功している.エンドソームをはじめとするオルガネラの高精細・高解像度のライブセルイメージング解析の結果も卓越したものである.これらのことから,本論文は,植物における細胞生物学的研究を大きく進展せしめた.

なお,本論文第1章は岡谷祐哉・植村知博・郷達明・庄田恵子・新濱充・森田(寺尾)美代・Christoph Spitzer・MarisaS.Otegui・中野明彦・上田貴志との共同研究であるが,論文提出者が主体となって実験及び検証を行ったもので,論文提出者の寄与が十分であると判断する.

したがって,博士(理学)の学位を授与できると認める.