In this thesis, the researches were focused on the development of solution systems of lignocellulosic materials by the use of common solvents and chemical analysis of plant cell wall components on the basis of these solutions. Dimethyl sulfoxide containing lithium chloride (LiCl/DMSO) was found to be used as a new solvent system for lignocellulosic materials. The dissolution of lignocellulosic materials in LiCl/DMSO was achieved by using two different pretreatment methods, ball milling pretreatment and ethylenediamine pretreatment. Pretreatment conditions were designed so that structural change of cell wall components during the whole dissolution process could be minimized. The new fractionation methods of lignin, lignin-carbohydrate complex (LCC) and polysaccharides from the lignocellulosic solution were established. Main concern of the analyses of obtained fractions was to elucidate the relationships and possible interactions between cellulose, hemicellulose and lignin.

Dissolution of milled wood in LiCl/DMSO

The LiCl/DMSO solvent system completely dissolved milled wood prepared by as short as 2 h of milling pretreatment using a planetary ball-mill. The nitrobenzene oxidation and ozonation analyses indicated that the structural change of lignin caused by the 2 h of milling is not significant. In contrast, the destruction of the cellulose crystalline region in the milled wood was serious even with 1 h of milling. Compared with already reported solvent systems, the advantages of the LiCl/DMSO system, developed in this thesis, are high solubility, low degradation of lignin and the simplicity of the solvent itself. Thus this solvent system can be applied widely to the spectral analyses of the entire lignin fraction in wood cell wall. For example, at the first time, the structural information of the whole aromatic part of lignin was obtained by measuring NMR of this complete wood solution. The gram absorptivity of lignin at 280 nm was obtained by measuring the UV absorbance of this solution. Interestingly, the absorptivity increased along with milling time, which suggested that gram absorptivity of lignin could be applied only to semi-quantitative determination. The wood solution forms gel at relatively high concentration by standing the solution at room temperature. The critical concentration for gelation increased along with milling time.

Dissolution of ethylenediamine pretreated lignocellulosic material in LiCl/DMSO

Milling pretreatment caused a minor but unavoidable structural change of lignin, cellulose and hemicellulose. Especially, in order to obtain the solution of lignocelluloses with high cellulose DP (degree of polymerization), another pretreatment method is required. From this point of view, the ethylenediamine pretreatment method was established for dissolution of lignocellulosic material. Various lignocellulosic samples, such as microcrystalline cellulose (Whatman CF11), cotton, cellulose I, cellulose II, holocellulose or kraft pulps (softwood, hardwood) including those with relatively high lignin content, were soaked in ethylenediamine for a described period at room temperature and then the bulk of ethylenediamine was removed by freeze drying. These ethylenediamine pretreated samples can be dissolved in LiCl/DMSO solvent system. Interestingly, even hardwood kraft pulp with as high as 10.5% lignin content gave the transparent solution. After the EDA pretreatment, the crystallinity of the lignocellulosic materials remained as high as the original samples, although the crystal structure changed. Because milling of the sample is not required, degradation of the cell wall components caused by milling does not take place. This is the first time that transparent solutions of underivatized pulps with high lignin content were obtained in a simple organic solvent system. The formation of a lignocellulose-EDA complex seems to be critical for the dissolution in LiCl/DMSO. The NMR spectrum of the EDA treated lignocellulosic solution had good resolution even though the DP of the cellulose in the pulp is very high. A very good relationship between UV absorbance of lignin at 280 nm in pulp solution and corresponding kappa number of pulp was obtained. Although the ethylenediamine pretreatment method is applicable to partially delignified samples, about 70% of the original wood meal without milling was found to be dissolved by repeating ethylenediamine pretreatment and dissolution in LiCl/DMSO.

Fractionation and characterization of wood cell wall components by using LiCl/DMSO system

One new and simple fractionation method of wood cell wall components by the use of LiCl/DMSO solvent system was acheived by varying the dissolving capacity of LiCl/DMSO system, i.e. by changing the LiCl concentration in DMSO. When LiCl concentration was higher than 6%, milling-pretreated wood meal completely dissolved in DMSO/LiCl, but when it was lower than this value, some part of milled wood was always left as an insoluble fraction depending on the LiCl concentration. Accordingly, different LiCl concentration gives different soluble and insoluble fractions, analyses of which must give new insight into the nature of cell wall components.

Nitrobenzene oxidation (N.O.) analysis revealed that the lignin in the insoluble fractions always had higher syringyl ratio, S/(S+V), and higher N.O. products yield, S+V, than corresponding soluble fractions, which indicated that the secondary wall type lignin with higher S/(S+V) ratio was more difficult to be dissolved than the primary wall type lignin with lower S/(S+V) ratio. With the increase in LiCl concentration in DMSO, the yield of soluble fraction increased and finally reached 100% when LiCl concentration was 6%. The proportion of lignin in each soluble fraction decreased, while the yield of S+V and the S/(S+V) ratio increased with the increase in the LiCl concentration. As to the solubilization behavior of carbohydrates, the most significant trend resulted from the increase in LiCl concentration of the solvent is the increase of the proportion of glucan (most presumably cellulose) in the fraction. It was safely stated that solubilization of cellulose controls the whole solubilization of milled wood. It was also clearly shown that about 40% of lignin and xylan dissolved independently from the cellulose solubilization but the solubilization of the rest was assisted by the cellulose solubilization.

When the concentration of LiCl reached 3%, about 90% of the milled wood dissolved. Although the remaining 10% dissolved completely by increasing the LiCl concentration to 6%, analysis of this fraction seems to give a key to understand the interaction between lignin, hemicellulose and cellulose.

本研究は、通常用いられる溶媒を用いて、リグノセルロース系試料を溶解できる溶媒システムを開発すること、そして、この溶媒形を用いた植物細胞壁の構成成分の化学分析法を確立することを目的とした。

塩化リチウムを含むジメチルスルホキシド(LiCl/DMSO)がリグノセルロース試料の新しい溶液として用いられることを見出し、その際必要となるリグノセルロース系試料の前処理として、ボールミル粉砕前処理、そして、エチレンジアミン前処理、の二つの方法を行った。これらの処理法は、リグノセルロース系試料を構成する化学成分の変質が最小になるように、との観点から確立された。次いで、この溶媒システムを用いたリグノセルロース系試料溶液から、リグニン、リグニン-糖結合体(LCC)、多糖類を分画する方法を確立した。この分画法を用いた分析の主要な目的は、植物細胞壁におけるリグニン、ヘミセルロース、セルロースの相互の関係と可能な相互作用を明らかにすることであった。

1. ボールミル磨砕前処理による木粉のLiCl/DMSOシステムへの溶解

LiCl/DMSO溶媒システムは、遊星式ボールミルによってある条件下で2時間磨砕した木粉を完全に溶解することができた。ニトロベンゼン酸化、オゾン酸化法による分析によって、この条件下での2時間の磨砕では、リグニンの構造変化は小さいことが明らかになった。一方、セルロース結晶領域は1時間の磨砕でもほぼ完全に消失した。すでに報告されている他の溶媒システムと比較した場合、LiCl/DMSO溶媒システムの利点は、溶解性が高いこと、リグニンの構造変化が遥かに小さいこと、および、単純な溶媒を採用していること、などである。溶媒として単純なことの利点は大変大きく、この溶液はそのまま、紫外線吸収、核磁気共鳴などのスペクトル分析に用いることができる。例えば、この溶媒を用いて、全木粉の核磁気共鳴スペクトルが誘導体化せずに、初めて測定された。また、細胞壁に存在する全リグニンを対象とした紫外吸収スペクトルや280nmにおけるグラム吸光係数も初めてこの溶媒システムによって測定された。このようにこの溶媒システムは、今後、木質細胞壁のスペクトル分析法の発展に大きく寄与すると期待される。

2. エチレンジアミン前処理によるリグノセルロース系試料のLiCl/DMSOシステムへの溶解

ボールミル磨砕前処理はセルロースの低分子化ならびに結晶領域の消失をもたらす。したがって、セルロース重合度を高く保ったままでリグノセルロース系試料を溶解するには別の前処理が必要となる。この観点からエチレンジアミン前処理法が開発された。リグノセルロース系試料をエチレンジアミンに漬けた後、ある一定程度までエチレンジアミンを取り除くと、試料はLiCl/DMSO溶媒システムに溶解する。この前処理法によっては木粉のように高いリグニン含有量の試料は溶解できないが、化学パルプを含めてリグニン含有量が11%ほどまでの試料や様々なセルロースを溶解することができる。この前処理によってセルロースの結晶型は変化するが、結晶化度や分子量は低下しないと考えられ、高リグニン含量セルロースの溶解法として様々な応用が期待される。

3. LiCl/DMSO溶媒システムを用いた木質細胞壁構成成分の分画と分析

LiCl/DMSO溶媒システムを用いた分画法は、リグノセルロース溶液を出発としてそれを貧溶媒に順じ滴下する分画法、前処理した固体試料を溶解力の低い溶媒から高い溶媒へと順じ溶解させ最終的に全てを溶解させる分画法、と言う基本的に異なった2つのものを試みた。溶媒の溶解力は、DMSO中におけるLiCl濃度を変えることによりコントロールした。従来の方法では、木質細胞壁の高々30%ほどが分画されるに過ぎず、残りの70%は分画されずに残された。本手法では、全木質細胞壁分画し溶液として分析することができる。その結果、溶媒の特性ならびに磨砕の程度が重要な因子となる区分(従来法で分画された区分)、それに加えてセルロースの溶解が因子となる区分、さらに木材成分間の相互作用も因子となる区分、の3区分が存在することを明らかにした。この最後の区分は、真の意味でのLCC(Lignin-Carbohydrate Comolex)であると考えられた。この区分の化学分析結果を他の区分のものと比較することにより、細胞壁を構成する成分間の結びつきにおけるヘミセルロースの重要性を明らかにした。

このように本研究では、リグノセルロース系試料の溶解法を確立することによって、従来では不可能であった木質細胞壁分析を可能にした。この成果は植物細胞壁化学構造のより良い理解を可能にする貴重な示唆に富んだものである。従って、審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。