Phthalate esters are used as plasticizers to produce polyvinyl chloride for a variety of consumer products, and environmental contamination occurs as a result of their manufacture, use or disposal by leaching out of plastic products. One of phthalates, di(n-butyl) phthalate (DBP), directly contaminated humans due to widely use as a plasticizer in cosmetics, printing inks and pharmaceutical coating. DBP have been shown to induce testicular atrophy characterized by degeneration of seminiferous epithelium. Thus, it is quite necessary to understand the mechanism of spermatogenic cell death induced by DBP due to lack of reports regarding that issue.

The present studies were conducted i) to characterize spermatogenic cell apoptosis induced by DBP, ii) to investigate whether DBP affects Sertoli cells and compromises the interactions between Sertoli and spermatogenic cell death, iii) to investigate the correlation between spermatogenic cell apoptosis and testicular steroidogenesis, and finally iv) to clarify estrogenic potency of DBP.

First, morphological alterations of testes and possible involvement of testicular steroidogenesis in testicular atrophy induced by repeated administration of DBP for 7 days were investigated. I also examined mRNA level of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) and uncoupling protein 2 (UCP2) expressions by real time RT PCR. Results showed that DBP caused significant reduction of testis weight and disruption of seminiferous tubules in a dose-dependent manner. A significant number of spermatogenic cell apoptosis was detected in the 500 mg/kg/day treated group. However, testicular steroidogenesis was almost identical to that of the control, indicating that testosterone level may not be associated with testicular atrophy induced by DBP. Interestingly, distinct lipid droplets in Sertoli and Leydig cells and increased mRNA expression of UCP2 and PEPCK were observed in the treated group. Since these genes are involved in energy homeostasis, DBP might affect Sertoli cells at least partly in energy producing system and may cause testicular injury.

Second, acute effects of DBP on Sertoli cell and spermatogenic cell apoptosis in prepubertal rats in vivo and in vitro were studied. I also examined the maturation of spermatogenic cells throughout the first wave of spermatogenesis in the DBP-treated rats. Results showed progressive detachment and displacement of spermatogenic cells toward the lumen after a single DBP administration. Ultrastructurally, several different-sized vacuoles were encountered in Sertoli cells and the junctions between Sertoli-spermatogenic cells. TUNEL assay revealed a maximum apoptotic index at 6 h, and then gradually decreased at 24 h after treatment, though still being significant. There was a correlation between spermatogenic cell apoptotic index and Sertoli cell vimentin filaments disruption in the treated rats. In agreement with the in vivo results, cultured Sertoli cells showed the increased number and size of vacuoles. Immunohistochemistry clearly revealed a gradual collapse of vimentin filaments in DBP-exposed Sertoli cells. In vivo and in vitro results suggested that the DBP-induced collapse in Sertoli cell vimentin filaments may lead to detachment of spermatogenic cells, and then detached cells undergo apoptosis due to loss of the support and nurture provided by Sertoli cells. In a recovery study, at D1, quite significant numbers of apoptotic spermatogenic cells were detected, and then they gradually decreased in accordance with the passage of time. In contrast, the testes revealed lower weight gain, even after completion of first wave of spermatogenesis in the treated group. Immunohistochemistry of Hsc 70t and PAS-hematoxylin staining showed reduction of mature spermatids in the treated testes. These results indicate that a single administration of DBP to prepubertal rats delays maturation of spermatogenic cells, even after completion of first wave of spermatogenesis.

Finally, I explored the estrogenic potency of DBP using 3-week-old male rats, and then examined the relationship between estrogen-induced spermatogenic cell apoptosis and testicular steroidogenesis. DBP treatment resulted in reduction of testicular steroidogenesis in addition to decreased level of serum LH at 3 h and serum FSH at 6 h, with an extremely high incidence of apoptotic spermatogenic cells at 6 h after administration. To elucidate the estrogenic activity of DBP, I carried out an inhibition study using pure antiestrogen ICI 182,780 (ICI) in a model of spermatogenic cell apoptosis induced by DBP or estradial-3-benzoate (EB). In an inhibition study, rats were ip administered with 3 mg/kg of ICI 4 h prior to administration of DBP or EB. Although both the DBP- and EB-treated groups showed a significant increase of spermatogenic cell apoptosis, ICI-pretreatment significantly decreased the number of apoptotic spermatogenic cells in these two groups. In contrast, testicular steroidogenesis and serum FSH were significantly reduced in all the treated groups, even in the DBP+ICI and EB+ICI groups. Taken together, these findings led me to conclude that estrogenic compounds such as DBP and EB induce spermatogenic cell apoptosis in prepubertal rats, probably by activating estrogen receptors in testes, and that reduction of testicular steroidogenic function induced by estrogenic compounds is not associated with spermatogenic cell apoptosis.

フタル酸エステル類はプラスティック製品の可塑剤として広く利用されており、環境への溶出が懸念されている物質である。その1種であるdi(n-butyl) phthalate (DBP)は、精巣萎縮を引き起こすことが知られているが、詳細な作用機序については不明である。

本研究ではDBPの精巣への毒性作用機序について明らかにするため、1)DBPにより誘起される精細胞アポトーシスの特徴を明確にする、2)DBPがセルトリ細胞に影響を与えるか否か、またセルトリ細胞-精細胞間の相互作用に関わるか否かについて検討する、3)精細胞アポトーシスとステロイド生成との関連性を検討する、さらに4)DBPのエストロゲン様作用を確認する-ことを試みた。

まず、DBPを3週齢のラットに濃度勾配(250,500,1,000mg/kg/day)をかけて、1日1回、7日間連続経口投与し、最終投与24時間後に精巣を採材し、光顕、透過型電顕、TUNEL法による形態変化、精巣内テストステロン濃度、およびステロイドホルモン合成酵素のmRNA発現レベルを解析した。その結果、DBPは有意な精巣重量の減少と精細管の萎縮をもたらした。500mg/kg/day投与群でアポトーシス精細胞数の有意な増加が見られ、1,000mg/kg/day投与群では精細胞の著しい脱落が認められた。しかし、精巣内テストステロン濃度およびステロイドホルモン合成酵素の発現レベルは対照群とほぼ同一であった。以上のことから、精巣内テストステロンはDBPによる精巣萎縮に関与しない可能性が示唆された。

次に、DBPの急性の影響について、3週齢のラットを用い、in viVOおよびin vitro実験系により検討した。3週齢ラットに500mg/kgのDBPを単回投与し、投与後、3、6、および24時間に精巣を採材し、実験に供した。その結果、DBP投与により、精細胞の脱落の進行が認められた。アポトーシス精細胞数を検討したところ、投与後6時間に最大となり、その後、24時間後まで徐々に減少した。また、アポトーシス精細胞数の増加とセルトリ細胞内のビメンチンフィラメントの崩壊との間に相関が認められた。3週齢ラット精巣より立ち上げたセルトリ細胞初代培養系を用いたin vitro実験においても、DBPを濃度勾配(0.1,1,100nmol/ml)をかけて投与後、6および24時間に観察したところ、セルトリ細胞内におけるビメンチンフィラメントの崩壊が、濃度依存的、時間依存的に認められた。これらの実験から、DBP投与によりセルトリ細胞内のビメンチンフィラメントの崩壊が誘起され、その結果、セルトリ細胞による支持を失った精細胞の脱落が起こり、脱落した精細胞はアポトーシスに陥ることが示唆された。

最後に、DBPのエストロゲン作用およびDBPないしエストロゲンにより誘起された精細胞アポトーシスと精巣内ステロイド生成の関連について実験を行った。3週齢のラットにDBPを単回投与し、投与後3、6、および24時間に精巣を採材し、アポトーシス精細胞数、精巣内テストステロン濃度、ステロイドホルモン合成酵素mRNAの発現、LH、ならびにFSHレベルを検討した。その結果、DBP投与ラットで、精細胞アポトーシスの増大、LH、FSHの減少、ステロイドホルモン合成酵素の発現レベルの減少、ならびに精巣内テストステロン濃度の減少が確認された。さらに、DBPのエストロゲン活性を検討するため、抗エストロゲン作用を有するICI 182,780(ICI)を用いて、DBPないし estradiol-3-benzoate (EB)投与により誘起された精細胞アポトーシスの抑制試験を行った。抑制試験においては、ラットにICIを前投与し、その後にDBPないしEBの投与を行った。DBPないしEB単独投与群においては、いずれも有意なアポトーシス精細胞数の増大が認められたが、ICI前投与群ではアポトーシス精細胞数の有意な減少が確認された。一方、すべての実験群において、精巣内テストステロンおよびFSHレベルは有意に減少していた。これらの結果を考え合わせると、DBPはエストロゲン様作用を示し、DBP投与により誘起される精細胞アポトーシスは精巣におけるエストロゲン受容体の活性化によりもたらされると考えられた。また、精巣内ステロイド生成の減少は精細胞アポトーシスに関与しない可能性が示唆された。

本研究は、DBPがエストロゲン作用を示し、またDBPにより誘起される精細胞アポトーシスが精巣内ステロイド生成と関与しないという新しい情報を提供しており、これらの研究成果は、獣医学学術上貢献するところが少なくない。よって,審査委員一同は,本論文が博士(獣医学)の学位論文として価値のあるものと認めた。