Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is an enveloped, positive-stranded RNA virus which belongs to the genus Pestivirus within the family Flaviviridae. As one of the best characterized prototype pestivirus, BVDV represents an attractive model system to study the replication of the closely related hepacivirus, hepatitis C virus (HCV). The viral genomes of BVDV and HCV encode single polyproteins, which are processed co- and posttranslationally by the viral and cellular proteases, yielding several functionally conserved gene products. The order and nomenclature of the cleavage products in the BVDV polyprotein are as follows: NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. Nonstructural protein 5A (NS5A) is a 56-58 kDa phosphorylated zinc metalloprotein and an essential component of HCV and BVDV replicase complexes Extensive studies on HCV NS5A and its molecular interactions with the host cell are available; however the exact function(s) of NS5A in the BVDV pathogenesis remains unknown. Since, no intrinsic enzymatic activities are performed by NS5A during BVDV pathogenesis it is assumed that it plays its functions through interactions with the host cell proteins. Unraveling these functions may be a clue to better understand the mechanisms involved in the replication and pathogenesis of BVDV.

In order to work with NS5A protein, it was essential to have a specific antiserum available. Therefore, with this aim, in CHAPTER 1, the author described the generation and characterization of monoclonal antibodies against the BVDV NS5A, by fusion of P3U1 myeloma cells with spleen cells from mice immunized with recombinant E. coli- expressed GST-NS5A protein. Two MAbs (1H12 and 2F9) were established on the basis of Immunofluorescence and Western blot analysis. Both the MAbs were of IgG1 subclass and recognized an epitope clustered within the N-terminal region of NS5A. The MAb 1H12 was used successfully to detect NS5A protein in BVDV field isolates belonging to genotypes 1 and 2. Temporal expression pattern studies during an infectious cycle revealed that BVDV NS5A could be detected 12-60 h post-infection. Confocal microscopy studies showed a cytoplasmic staining pattern and revealed that NS5A is localized along with NS3 on the endoplasmic reticulum membrane in BVDV infected cells.

In the second CHAPTER of thesis, the author identified a protein kinase which phosphorylates and binds BVDV NS5A. It is well known that same or similar serine/threonine protein kinase phosphorylates NS5As from HCV and BVDV. Several cellular protein kinases, including protein kinase A (PKA), casein kinase I (CKI), CKII, MAPK and MEK family members were demonstrated as candidates for HCV NS5A phosphorylation; however which particular protein kinase is responsible for BVDV NS5A phosphorylation is not known. In an attempt, E. coli expressed GST-NS5A fusion protein was used as a substrate for PKA, CKII and cdc2 cyclin-dependant kinase (CDK1). In vitro kinase assays were performed and a proline-directed cdc2/cyclin B1 complex was found to be responsible for phosphorylation of BVDV NS5A, consistent with the previous kinase inhibitor studies whereas PKA and CKII were unable to phosphorylate BVDV NS5A. Using KinasePhos, a putative cdc2 site was found in NS5A protein at Thr292 which was mutated to alanine as GST-NS5AmutT292A to block phosphorylation. Assessment of this NS5A mutant in kinase assay suggested that Thr292 in NS5A was the target site of cdc2 protein kinase. Moreover, in consistent with a previous report on HCV NS5A, cellular cdc2 was coimmunoprecipitated with NS5A in BVDV infected cells indicating a physical association of cdc2 with NS5A.

Although there is a growing list of proteins that interact with HCV NS5A, knowledge about the binding partners of BVDV NS5A is scarce. Therefore, one of the major goals of this study was the identification of novel binding partner(s) of NS5A through yeast two-hybrid technique. In CHAPTER 3, the author described a novel protein-protein interaction between BVDV NS5A and the host which is involved during BVDV RNA replication. To identify the cellular proteins, a yeast two-hybrid screen using MDBK cDNA library was performed using NS5A N-terminus as bait. As a result, a celluar protein termed NIK (nuclear factor kappa B inducing kinase) and IKK-fl binding protein (NIBP) was identified which is implicated in NF-icB signaling and membrane trafficking in the cells. The interaction of NS5A with NIBP was confirmed by both in vitro and in-vivo. Complementing the GST-pull down and immunoprecipitation data are the confocal immunofluorescence results indicating that NS5A co-localized with NIBP in the cytoplasm of BVDV infected cells. Moreover, the minimal residues of NIBP which interact with NS5A were mapped from amino acids 597 to 623. In addition, over-expression of NS5A inhibits tumor necrosis factor (TNF)-a induced NF-KB activation in HEK293 and LB9.K cells as determined by luciferase gene reporter assay. Further it was shown that inhibition of endogenous NIBP by small interfering RNA molecules enhanced viral replication indicating the importance of NIBP implications in BVDV pathogenesis.

As stated above, the author described the first attempt towards the generation and characterization of MAbs against BVDV NS5A and by utilizing these MAbs, he was able to characterize the NS5A in BVDV infected cells. Since NS5A is a phosphor-protein, possibly it might have a regulatory role in viral replication as is the case with HCV NS5A. Using NS5A as a substrate, the author identified a cdc2 cyclin-dependent kinase which binds and phosphorylates NS5A at Threonine 292. The finding may suggest that BVDV perhaps affects the cellular growth activities. Since BVDV cause persistent infection in the host and cdc2 has been shown to regulate the cell cycle, the role of NS5A phosphorylation in BVDV persistent infections will be helpful in devising the future studies. To further explore the possible implicated signaling pathways during BVDV pathogenesis, he was able to identify a novel protein named NIBP using NS5A as bait in yeast two-hybrid technique. Since NIBP is involved in the cytokine-mediated NF-kB activation, these findings will contribute to better understand the mechanism of BVDV pathogenesis. Moreover, being the first reported interaction between NIBP and a viral protein, this finding suggest a new mechanism whereby viruses may subvert host cell machinery for mediating trafficking as well as NF-kB signaling.

牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)は、エンベロープを有し、プラス1本鎖をゲノムに持つ。フラビウイルス科、ペスチウイルス属に分類され、ペスチウイルス属の中では最も研究が進んでいるウイルスである。また、ヒトのC型肝炎増殖のモデルとしての研究も進められている。BVDVのゲノムは単一のポリ蛋白をコードしており、このポリ蛋白がウイルス由来ないしは細胞由来蛋白分解酵素によって、機能を有する蛋白に開裂する。開裂蛋白の名称と順序は、アミノ末端からNpro、C、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5Bである。非構造蛋白5A(NS5A)は56-58 kDaのリン酸化された亜鉛結合性蛋白で、ウイルス複製に必須である。しかし、BVDVの病原性発現におけるNS5Aの機能は全く知られていない。NS5Aに酵素活性は認められないため、恐らく宿主細胞因子との相互作用により病原性に関与していると考えられる。従って、NS5Aの機能を解明することにより、BVDVの増殖や病原性発現メカニズムが明かとなることが期待される。

NS5Aの研究を行うためには、特異的抗血清を用いることが必須である。このため、第1章では、BVDV NS5Aに対するモノクローナル抗体(MAb)を作成した。NS5Aをグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合蛋白として大腸菌を用いて発現させ、マウスを免疫した。2種のMAbが得られ、両抗体ともNS5Aのアミノ末端領域を認識していた。このうち、MAb 1H12はBVDV野外株の遺伝子型1および2を共に検出することに成功した。この抗体を用いることで、ウイルス感染細胞において感染後12~60時間の期間NS5Aが検出された。共焦点レーザー顕微鏡を用いた観察では、NS5AはNS3と共に、感染細胞の小胞体膜に局在した。

第2章では、NS5Aのリン酸化に関与する酵素の同定を行った。いくつかの宿主リン酸化酵素、例えばプロテインキナーゼA(PKA)、カゼインキナーゼI(CKI)、CKII、MAPKおよびMEK関連酵素群は、その候補と考えられている。しかし、どの酵素が主要な働きをするのかは知られていない。そこで、第1章で構築したGST融合NS5Aを基質とし、3種のリン酸化酵素(PKA、CKII、MAPK関連酵素群の一つであるcdc2)によるin vitroリン酸化反応を行った。この結果、PKAとCKIIはNS5Aをリン酸化出来なかったが、cdc2によるリン酸化が認められた。また、リン酸化部位と考えられるアミノ酸を変異させたNS5Aはcdc2によるリン酸化が認められなかった。即ち、BVDV NS5Aが宿主細胞のリン酸化酵素であるcdc2によってリン酸化されることを、初めて明らかとした。

第3章では、NS5Aと結合する宿主因子を探索した。NS5Aのアミノ末端領域をベイトとし、イースト2ハイブリッド法を用いたスクリーニングを行った結果、牛腎臓由来継代細胞であるMDBK細胞のcDNAライブラリーからNIBP(NIK and IKK-β binding protein)と呼ばれる因子を同定することが出来た。NIBPはNF-κBシグナル伝達に関与する因子である。NS5AとNIBPの相互作用は、GSTプルダウン法、免疫沈降法、共焦点レーザー顕微鏡観察によって確認された。さらに、NIBPの欠損変異体を作出することにより、アミノ酸領域の597から623の領域がNS5Aとの結合に関与していることも明かとした。また、NS5Aの過剰発現によりTNF-αによるNF-κBの活性化が阻害されること、ウイルス感染細胞においてNIBPをsiRNAによって抑制した結果、ウイルス増殖が増加することも明らかとなった。これは、NS5Aが細胞因子のNIBPと結合することにより、ウイルスの増殖や病原性発現に影響を与えていることを示唆していると考えられ、BVDVはもとより類似ウイルスでも初めての知見である。

以上本論文は、特異的抗体作成やウイルス非構造蛋白と細胞因子の相互作用を明らかとすることで、BVDV感染細胞におけるウイルス増殖とその結果である細胞異常、即ち病原性発現メカニズム解明に道を開いたものであり、学術上獣医学のみならず、医学にも貢献することが少なくない。よって、審査委員一同は本論文が博士(獣医学)論文として価値あるものと認めた。