研究の背景と目的

近年血管内皮において種々の刺激で引き起こされる炎症反応が動脈硬化等の慢性炎症性疾患の進展に深く関わることが明らかになってきた。炎症時、血管内皮細胞表面に接着因子が発現誘導され、また、内皮細胞におけるケモカイン、炎症促進性サイトカインの発現上昇によってリンパ球や単球といった炎症細胞の血管壁への動員・接着が促進され、続いて血管外の組織への遊走が引き起こされる。現在のところこれらの一連の流れが動脈硬化初期病変進展過程と考えられている。

このように、動脈硬化症等の慢性的炎症を引き起こしている部位の血管内皮細胞ではvascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)等の接着因子が発現亢進していることが知られている。ゆえに、このような細胞接着の慢性的な発現上昇は慢性炎症性疾患の進展に寄与することが考えられる。接着因子の1つであるVCAM-1の発現誘導を引き起こすアゴニストはtumor necrosis factor-α (TNF-α)等の急速かつ一過性の発現誘導を行うグループと、interleukin-4 (IL-4)等の持続的な発現誘導を行うグループの2つのグループに大別され、その発現誘導パターンから慢性炎症性疾患において重要なのは後者のIL-4のような持続的な発現誘導を行うグループだと考えられる。

IL-4は主にTh2細胞によって分泌され、Th2細胞の細胞分化、B細胞におけるIgE産生細胞へのクラススイッチなど、複数の機能を持った免疫調節性サイトカインである。慢性炎症性疾患を罹患している患者や動脈硬化病変部位において高い発現が観られ、VCAM-1等の接着因子の持続的な発現誘導を行うことによって慢性炎症性疾患の進展に重要な役割を果たしていると考えられる。しかしながら、IL-4が血管内皮細胞内においてどのような分子機構でVCAM-1を発現誘導しているのかについてはまだ解明されていない。そこで、本研究ではIL-4とIL-4特異的に活性化される転写因子STAT6による血管内皮細胞のVCAM-1等の転写活性化機構の解明を目指して実験を行った。

実験結果と考察

TNF-α刺激、もしくはIL-4刺激によるVCAM-1発現誘導パターンの違い

VCAM-1は血管内皮細胞においてTNF-α、IL-4などのサイトカインによって発現誘導が行われるが、TNF-α刺激もしくはIL-4刺激によるVCAM-1の発現誘導がどのような経時的変化を示すのかを調べるため、HUVECをTNF-αもしくはIL-4で刺激し、刺激4時間、12時間、24時間後におけるVCAM-1 mRNAの量の経時的変化をreal-time PCRによって測定した。TNF-α刺激の場合、4時間後をピークとしてVCAM-1の急激な転写誘導が起き、12、24時間後と時間が経過するに従いVCAM-1の発現誘導が収まっていることが示している。対してIL-4刺激の場合、4時間後でTNF-αと比較して弱いVCAM-1転写誘導が観られ、12時間後に若干転写量が減少するものの、24時間後には再びVCAM-1転写物の増加が観られた。このことから、TNF-αは急性のVCAM-1発現誘導を行い、IL-4では持続的・慢性的なVCAM-1発現を行っており、2つのサイトカインは異なる誘導機構によってVCAM-1の発現誘導を行っていることが考えられる。

各種阻害剤を用いたIL-4シグナル阻害実験

IL-4がどのようなシグナル経路を経由してVCAM-1の発現誘導を行っているのかを調べるために、PKCδ(10μM Rottlerin)、PKC (5μM BisindolylmaleimideI(BIM))、PI3K (50μM LY294002)、MEK (50μM PD98059)、p38 MAPK (20μM SB203580)の各種阻害剤を用いてシグナル阻害実験を行った。HUVECへのIL-4刺激30分前にDMSO溶液の各種阻害剤で処理し、IL-4刺激4時間後のVCAM-1 mRNAの転写量をreal-time PCRによって測定した。その結果、刺激前と比較してRottlerinが85%、BIMが67%、LY294002が95%、SB203580が91%のVCAM-1の発現誘導を抑制した。また、PD98059に関しては抑制が観られなかった。このことから、IL-4によるVCAM-1発現誘導におけるシグナルはPKC、PI3K、p38 MAPKを経由し、MEKを経由しないことが明らかになった。

血管内皮細胞におけるIL-4による遺伝子発現の経時的変化に対する網羅的解析

IL-4が血管内皮細胞においてどのような経時的変化を引き起こしているのかを網羅的に解析するため、DNAマイクロアレイ解析を行った。HUVECに対してIL-4刺激を行い、1、2、4、8、16時間後の転写量を刺激前の状態と比較した。2倍以上の増加が観られた遺伝子が1時間で26、2時間で47、4時間で60、8時間で76、16時間で124種類あった。また、常に発現誘導されるグループと、ある程度誘導された後に誘導が抑制され、その後再び徐々に発現誘導されるグループの2つに大別された。

細胞質・核の分画によるSTAT6の経時的な局在変化

IL-4で刺激されると血管内皮細胞を含む多くの細胞では細胞内においてSTAT6の641番目のチロシンがリン酸化され、二量体を形成することによりSTAT6が核内に移行することが知られている。そこで、血管内皮細胞におけるIL-4刺激時のSTAT6の経時的な挙動を調べるため、HUVECをIL-4で刺激し、15分、30分、1時間、2時間、4時間後に分画を行い、細胞質画分と核画分を得てSTAT6をはじめ、各種に対する抗体でWestern Blottingを行うことによってIL-4によるSTAT6の核移行の経時的変化を追った。その結果、STAT6は刺激15分後細胞質では刺激前と比較して減少し、その後増加していた。また、核におけるSTAT6は15分後大きく増加し、その後徐々に減少していた。さらにリン酸化STAT6に関して調べると、細胞質におけるリン酸化STAT6は15、30分後で増加し、その後減少していた。また、核内においても同様な傾向が観られた。これらのことから核におけるSTAT6はリン酸化STAT6の動向と同調していることがわかり、STAT6はIL-4によるリン酸化が起こることにより核内に移行していることが示唆された。また、TNF-α刺激によって核内に移行し、転写の活性化に作用することが知られているp65に関してもIL-4刺激による動向を調べてみたが、p65の核移行や量の変化は観られなかった。よって、HUVECにおけるIL-4刺激によるシグナル伝達ではp65を介さないことが考えられる。

STAT6ノックダウンによりIL-4刺激での誘導を抑制された遺伝子に対する網羅的解析

STAT6のノックダウンにより、どのような遺伝子がIL-4刺激での発現誘導を抑制されるのかを網羅的に解析するため、siRNAを用いてSTAT6のノックダウンを行い、IL-4刺激によるVCAM-1発現誘導に対する影響を調べた。HUVECに対してsiRNAのTransfectionを行い、その26時間後に0.5% FBS入りEBM-2で18時間Serum Starvationを行った。また、Transfectionから44時間後にIL-4で4時間刺激した後RNAを回収し、Real-time PCRによりVCAM-1転写量の測定を行った。その結果2種類のsiRNA共にノックダウンの効果が認められ、またVCAM-1の発現誘導が抑制された。このことから、IL-4によるVCAM-1の発現誘導においてSTAT6が必要であることがわかった。次に、STAT6のノックダウンによりIL-4シグナルで誘導される遺伝子発現がどのように変化するかを網羅的に解析するためにDNAマイクロアレイ解析を行った。IL-4により2倍以上誘導が観られ、かつsiRNAにより誘導が1/2倍以下に抑制されたものが、#1のsiRNAでは76、#2のsiRNAでは82種類の遺伝子が得られた。また、共通2種類のsiRNAで共通して得られた遺伝子は62種類であった。

アデノウィルスによる常時活性型STAT6の強制発現下における遺伝子発現の網羅的解析

547番目のバリンと548番目のスレオニンをどちらもアラニンに置換した常時活性型STAT6を強制発現させるためのアデノウィルスを作成し、HUVECに感染させ、48時間後にRNAを回収してDNAマイクロアレイ解析によっていかなる遺伝子発現が観られるか網羅的に解析した。2倍以上の発現誘導が観られた遺伝子は1000種類以上あった。

上述の結果合わせて、STAT6ノックダウンによって顕著に誘導抑制され、かつ、常時活性型STAT6の強制発現によって顕著に誘導された遺伝子として、特にCCL26、POSTN、PMCH、SOCS1、VCAM1、CISH、HAS3、SELP、ARG99(TMTC1)などが挙げられ、これらの遺伝子はIL-4/Stat6シグナルの下流にあることが示唆された。

全ゲノムクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-Seq)法を用いたゲノム上におけるSTAT6結合部位の網羅的解析

IL-4刺激によって核移行したSTAT6がゲノム上のどの部位に結合し、STAT6下流の遺伝子の転写に関与しているのかを解析するために、HUVECを50 ng/ml IL-4で刺激し、その1時間後に細胞を固定化、回収し、抗STAT6抗体を用いたクロマチン免疫沈降実験を行い、ChIP-Seq法を用いてゲノム上におけるSTAT6結合部位について網羅的な解析を行った。この結果、上述したIL-4/Stat6シグナル下流にあることが示唆された9遺伝子全ての遺伝子近傍にSTAT6結合可能性を示すピークが得られた。よってこのChIP-Seq法による解析結果は妥当なものであると考えられ、上に挙げた9遺伝子がSTAT6下流にあることを強く示唆するものである。

VCAM-1遺伝子近傍におけるSTAT6結合領域に対する転写活性化機能の検討

ChIP-Seq法によるSTAT6結合領域の網羅的解析の結果、VCAM-1遺伝子近傍には転写開始点から上流-16 kb、-11 kb、第8イントロン(int 8)の3領域にピークが観られ、これらの領域はenhancerであることを示すヒストンH3の4番目のリジンのモノメチル化(H3K4me1)も観られている。この領域についてreal-time PCRによるChIP-PCR法で実際にSTAT6が結合していることが確認できた。そこで、レポーターベクターpGL3-Basicを基に、Luciferase遺伝子の上流にVCAM-1 core promoterを組み込んだレポーターベクターを作製し、さらにその上流に-16 kb領域、-11 kb領域、もしくはint 8領域の各領域を組み込んだレポーターベクターを用いてHUVECにおいてLuciferase Reporter Assayを行い、各領域の転写活性化機能について検討を行った。その結果、常時活性型STAT6(STAT6VT)の強制発現下で-16 kb領域を組み込んだ場合にのみルシフェラーゼ活性が上昇し、-16 kb領域のSTAT6依存的な転写活性化機能が示唆された。

また、-16 kb領域についてさらに詳細に検討するため、-16 kb領域に存在する2箇所のSTAT6コンセンサス配列にそれぞれ変異を入れたコンストラクトを用いてSTAT6VTの強制発現下、同様な実験を行った。その結果、VCAM-1転写開始点のより近位に位置するSTAT6コンセンサス配列に変異を入れた場合には活性がベースラインにまで下降した。一方転写開始点から遠位に位置するSTAT6配列に変異を入れた場合には活性はほぼ半減した。

また、STAT6VTの代わりにIL-4刺激を行って同様な実験を行った場合には近位のSTAT6配列に変異を入れると活性がベースラインまで下降し、遠位のSTAT6配列に変異を入れると顕著な差は観られなかった。以上の結果から、どちらのSTAT6配列もSTAT6依存の転写活性化機能に関与すると考えられるが、特に近位のSTAT6配列が重要であると言える。

この領域はenhancerとして機能していることが考えられることから、STAT6は-16 kb領域のenhancerに結合し、VCAM-1の転写活性化を引き起こしているのではないだろうか。

結論

血管内皮細胞において、IL-4刺激はVCAM-1遺伝子上流-16 kb領域のenhancerにSTAT6の結合を引き起こし、VCAM-1の転写活性化を行い、慢性炎症性疾患の進展に寄与する。

本研究は動脈硬化症等の慢性炎症性疾患において重要な役割を演じていると考えられるIL-4/Stat6シグナルにおける炎症性因子の転写活性化機構について明らかにするため、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)においてIL-4刺激による転写因子STAT6の活性化を介したシグナル伝達系にてVCAM-1等の転写活性化機構について解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1.IL-4が血管内皮細胞においてどのような経時的変化を引き起こしているのかを網羅的に解析するため、DNAマイクロアレイ解析を行った。HUVECに対してIL-4刺激を行い、1、2、4、8、16時間後の転写量を刺激前の状態と比較した。2倍以上の増加が観られた遺伝子が1時間で26、2時間で47、4時間で60、8時間で76、16時間で124種類あった。また、常に発現誘導されるグループと、ある程度誘導された後に誘導が抑制され、その後再び徐々に発現誘導されるグループの2つに大別された。

2.IL-4によって特異的に活性化することが知られている転写因子STAT6の、血管内皮細胞におけるIL-4刺激時の経時的な挙動を調べるためHUVECをIL-4で刺激し、15分、30分、1時間、2時間、4時間後に分画を行い、細胞質画分と核画分を得てSTAT6をはじめ、各種に対する抗体でWestern Blottingを行うことによってIL-4によるSTAT6の核移行の経時的変化を追った。その結果、STAT6は刺激15分後細胞質では刺激前と比較して減少し、その後増加していた。また、核におけるSTAT6は15分後大きく増加し、その後徐々に減少していた。さらにリン酸化STAT6に関して調べると、細胞質におけるリン酸化STAT6は15、30分後で増加し、その後減少していた。また、核内においても同様な傾向が観られた。これらのことから核におけるSTAT6はリン酸化STAT6の動向と同調していることがわかり、STAT6はIL-4によるリン酸化が起こることにより核内に移行していることが示唆された。また、TNF-α刺激によって核内に移行し、転写の活性化に作用することが知られているp65に関してもIL-4刺激による動向を調べてみたが、p65の核移行や量の変化は観られなかった。よって、HUVECにおけるIL-4刺激によるシグナル伝達ではp65を介さないことが考えられた

3.STAT6の下流にある遺伝子を同定するため、STAT6のノックダウンにより、どのような遺伝子がIL-4刺激での発現誘導を抑制されるのか、また、逆に常時活性型STAT6(STAT6VT)の強制発現下でどのような遺伝子が発現誘導されるのかをDNAマイクロアレイを用いて網羅的な解析を行った。その結果、STAT6によって特に顕著に影響を受けた遺伝子としてCCL26、POSTN、PMCH、SOCS1、VCAM1、CISH、HAS3、SELP、ARG99(TMTC1)といった遺伝子が挙げられ、これら9遺伝子はSTAT6の下流にあると考えられた。

4.IL-4刺激によって核移行したSTAT6がゲノム上のどの部位に結合し、STAT6下流の遺伝子の転写に関与しているのかを解析するために、HUVECをIL-4で刺激し、その1時間後に細胞を固定化、回収し、抗STAT6抗体を用いたクロマチン免疫沈降実験を行い、ChIP-Seq法を用いてゲノム上におけるSTAT6結合部位について網羅的な解析を行った。この結果、上述したIL-4/Stat6シグナル下流にあることが示唆された9遺伝子全ての遺伝子近傍にSTAT6結合可能性を示すピークが得られた。よってこのChIP-Seq法による解析結果は妥当なものであると考えられ、上に挙げた9遺伝子がSTAT6下流にあることを強く示唆するものである。

5.ChIP-Seq法によるSTAT6結合領域の網羅的解析の結果、VCAM-1遺伝子近傍には転写開始点から上流-16 kb、-11 kb、第8イントロン(int 8)の3領域にピークが観られ、これらの領域はenhancerであることを示すヒストンH3の4番目のリジンのモノメチル化(H3K4me1)も観られている。この領域についてreal-time PCRによるChIP-PCR法で実際にSTAT6が結合していることが確認できた。そこで、レポーターベクターpGL3-Basicを基に、Luciferase遺伝子の上流にVCAM-1 core promoterを組み込んだレポーターベクターを作製し、さらにその上流に-16 kb領域、-11 kb領域、もしくはint 8領域の各領域を組み込んだレポーターベクターを用いてHUVECにおいてLuciferase Reporter Assayを行い、各領域の転写活性化機能について検討を行った。その結果、常時活性型STAT6(STAT6VT)の強制発現下で-16 kb領域を組み込んだ場合にのみルシフェラーゼ活性が上昇し、-16 kb領域のSTAT6依存的な転写活性化機能が示された。

6.-16 kb領域についてさらに詳細に検討するため、-16 kb領域に存在する2箇所のSTAT6コンセンサス配列にそれぞれ変異を入れたコンストラクトを用いてSTAT6VTの強制発現下、同様な実験を行った。その結果、VCAM-1転写開始点のより近位に位置するSTAT6コンセンサス配列に変異を入れた場合には活性がベースラインにまで下降した。一方転写開始点から遠位に位置するSTAT6配列に変異を入れた場合には活性はほぼ半減した。また、STAT6VTの代わりにIL-4刺激を行って同様な実験を行った場合には近位のSTAT6配列に変異を入れると活性がベースラインまで下降し、遠位のSTAT6配列に変異を入れると顕著な差は観られなかった。以上の結果から、どちらのSTAT6配列もSTAT6依存の転写活性化機能に関与すると考えられるが、特に近位のSTAT6配列が重要であると言える。この領域はenhancerとして機能していることが考えられることから、STAT6は-16 kb領域のenhancerに結合し、VCAM-1の転写活性化を引き起こしていると考えられた。

以上、本論文はヒト臍帯静脈血管内皮細胞HUVECにおけるIL-4/Stat6シグナルによる転写活性化機構の解析から、IL-4によって発現誘導されるVCAM-1の転写開始点上流-16 kb領域にSTAT6依存性VCAM-1転写活性化機能があることを明らかにした。本研究はこれまで未知であったIL-4によるVCAM-1の発現誘導機構の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。