G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest superfamily of integral membrane proteins, which are activated by specific compounds called "ligands", and transduce signals intracellularly through heterotrimeric G proteins. GPCRs share a common topology, with seven-transmembrane domains. Three-dimensional structural analysis of several GPCRs revealed that the membrane-proximal C-terminal tail forms an additional α-helix, known as Helix 8 (H8) with amphipathic properties. To date, several studies have demonstrated the role of H8 in ligand binding and/or G protein activation. However, the role of this domain in the proper folding of the receptor for passage through the quality control mechanism of the endoplasmic reticulum (ER) remains poorly defined.

Leukotriene B4 (5S, 12R-dihydroxy-6,14-cis-8,10-trans-eicosatetraenoic acid [LTB4]), a metabolite of arachidonic acid, is a potent lipid mediator. Two GPCRs that interact with LTB4, a high affinity type-1 receptor (BLT1) and a low-affinity type-2 receptor (BLT2), have been cloned in our laboratory. Recently, our laboratory have reported that BLT2 recognizes 12S-hydroxy-5-cis-8,10-trans-heptadecatrienoic acid (12-HHT, a cyclooxygenase product) with a higher affinity than LTB4.

Here, I demonstrate that the lack of H8 leads to accumulation of human (h) BLT2 in the ER, suggesting the importance of this domain for the correct folding of hBLT2 during de novo synthesis and trafficking. Firstly, I showed that lack of H8 of the hBLT2 led to an accumulation of the receptor (hBLT2/ΔH8) in the ER by flow cytometry and immunofluorescence confocal microscopy. Similar results were obtained in two representative human GPCRs, dopamine type-1 and lysophosphatidic acid type-2 receptors, that were engineered to lack H8.

Several lines of evidence suggest that a class of compounds called "pharmacological chaperones" rescue the intracellular retention of several misfolded proteins, including GPCRs. To examine whether the accumulation of hBLT2/ΔH8 in the ER is due to an inadequate folding, I tested the effect of several ligands for hBLT2, which might behave as pharmacological chaperones. Treatment with chemical ligands or natural agonists dose-dependently and time-dependently facilitated the surface expression of hBLT2/ΔH8. These results suggest that the lack of the H8 led to the inadequate folding of the hBLT2. Additionally, I demonstrated the importance of the hydrophobic residues, Phe-Leu-x-x-Leu-Phe, in H8 for hBLT2 trafficking. Recently, several studies have analyzed the trafficking of GPCRs, e.g. rat (r) D1R, hV2R, hV1b/3R, hMC4R, rAT1R and rα2B-AR. These efforts to elucidate the mechanism underlying GPCR export from the ER have led to the identification of amino acid sequences in the C-terminal tail that play a crucial role in their export. Because these critical residues partially or totally constitute the putative H8 of each GPCR, the results support our hypothesis that the hydrophobic residues in H8 are important for the receptors to pass the quality control mechanism in the ER.

The surface-trafficked hBLT2/ΔH8 exhibited an agonist-evoked increase in Ca2+, demonstrating that H8 is not critical for ligand binding and activation of coupled G proteins. This implies that H8-deficient hBLT2 could be a "functional mutant". Thus, our findings suggest that some diseases caused by a deficiency of GPCR trafficking are due to mutations in H8. I conclude that the H8 region of hBLT2 plays an important role in transport-competent receptor folding. Discovery of this role of H8 in the correct folding of the receptors is useful for a better understanding of ER quality control mechanism for GPCRs.

本研究は、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)が有するHelix 8構造が小胞体での品質管理過程の通過、即ち小胞体搬出において重要であることを明らかにしたものである。本研究では、主にロイコトリエンB4第二受容体(BLT2)を用い、そのHelix 8変異体の細胞内局在解析や、特異的リガンドの変異BLT2に対する薬理学的シャペロン作用の解析を試みることで下記の結果を得た。

1.BLT2のHelix 8欠損変異体(BLT2/ΔH8)を作製し、形質膜における受容体の発現量をflow cytometry解析した。その結果、BLT2の野生型(BLT2/WT)に比べてBLT2/ΔH8の形質膜発現量は著しく低下していた。さらに、共焦点顕微鏡観察による細胞内局在解析やN型糖鎖特異的なグリコシダーゼを用いた修飾解析より、BLT2/ΔH8は小胞体に蓄積していることを明らかにした。

2. BLT2以外にもドパミン1型受容体(D1R)やリゾフォスファチジン酸2型受容体(LPA2)のHelix 8欠損変異体を作製し、これら変異GPCRも野生型に比べて形質膜発現が有意に低下していること、並びにBLT2/ΔH8同様、小胞体に蓄積していることを確認した。

3. BLT2のHelix 8内点変異体を多数作製し、各変異体の形質膜発現量を解析した結果、Helix 8内の疎水性アミノ酸残基のアラニン置換で受容体の形質膜発現量は、著しく低下することを見出した。

4. 細胞培養液中にBLT2の合成リガンド、或は内因性リガンドを添加すると、BLT2/ΔH8の形質膜発現量は経時的、且つ、リガンド濃度依存的に増加した。これらリガンドが薬理学的シャペロンとして働き、BLT2/ΔH8の形質膜輸送を促進したと推察した。

5. 薬理学的シャペロンの作用で形質膜に発現させたBLT2/ΔH8は、BLT2/WTと同様、内因性アゴニストに対し、濃度依存的な細胞内カルシウム応答を起こした。

以上、本論文はHelix 8を欠損させたBLT2やD1R、LPA2変異体の解析から、Helix 8構造が受容体の小胞体搬出に重要であることを明らかにした。また、小胞体に蓄積したBLT2/ΔH8が特異的リガンドの薬理学的シャペロン作用で形質膜に移送されたことから、Helix 8が小胞体におけるBLT2の立体構造の形成や維持に重要であることが推察された。さらに、これまでC末端領域内にER搬出モチーフが同定されていた幾つかのGPCRにおいて、それらがHelix 8を構成するアミノ酸であることを見出し、こうした知見からもHelix 8の小胞体搬出における重要性を示唆した。これまでHelix 8はシグナル伝達における役割以外はほとんど知られていなかったが、本研究はGPCRの小胞体搬出におけるHelix 8構造の新たな重要性を明らかにした。ある種の疾患が、Helix 8構造の遺伝的変異で当該GPCRが小胞体内蓄積することに起因する場合、薬理学的シャペロンが治療法として有用である可能性を示唆することにもなり、学位の授与に値するものと考えられる。