Lysophosphatidic acid (LPA) is a bioactive lipid mediator with diverse physiological and pathological actions on many types of cells. LPA has been considered to elicit its biological functions through three types of endothelial differentiation gene (EDG) family of G protein-coupled receptors (GPCRs), LPA1-3. However, even after the identification of these LPA receptors, the existence of an additional LPA receptor(s) has been implied by several studies. In 2003, our group identified p2y9/GPR23 as a fourth LPA receptor, LPA4, which is structurally distant from EDG family LPA receptors. The expressed sequence tag cDNA encoding LPA4 was originally isolated from human brain, and LPA4 is expressed in many kinds of mouse/rat neural cells. However, only very limited information is available on its neurological functions.

To assess the functions of LPA4 in neuronal cells, I used rat neuroblastoma B103 cells that appear to lack endogenous responses to LPA. Unlike B103 cells transfected with control vector, B103 cells stably expressing LPA4 (B103-LPA4 cells) showed contracted cell shapes and formed aggregates in a serum-containing medium, which is rich in LPA. In B103-LPA4 cells, I observed Gq/11-dependent calcium mobilization, whereas LPA did not affect adenylyl cyclase activity, indicating that LPA4 does not couple to Gs and Gi/o protein. I also found that LPA induced dramatic morphological changes of B103-LPA4 cells, i.e., neurite retraction, cell aggregation, and N-cadherin-dependent cell adhesion, which are consistent with the characteristic appearance of B103-LPA4 cells in a serum-containing medium. The morphological changes were inhibited by the treatment with a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, Y27632. On the other hand, the treatment with Gi/o inhibitor pertussis toxin and Gq(/11) inhibitor YM-254890 did not inhibit the morphological changes, suggesting the role of G(12/13)-dependent Rho/ROCK activation in morphological changes in neuronal cells.

In 2006, the orphan GPCR GPR92 was identified as a fifth LPA receptor (LPA5). GPR92 is closely related to LPA4, with a 28% amino acid identity in human. Of note, another orphan receptor, p2y5 shares the highest amino acid sequence homology (59%) with LPA4 among all GPCRs, suggesting that p2y5 is also an LPA receptor. Although I could not detect p2y5-dependent response to LPA in cyclic AMP assay, Ca(2+) mobilization assay, or reporter gene assay, I noticed that B103 cells stably expressing p2y5 (B103-p2y5 cells) formed aggregates in a serum-containing medium. This similar morphology of B103-p2y5 cells to B103-LPA4 cells led me to hypothesize that LPA activates Rho through p2y5 in these cells. This hypothesis was confirmed by following experiments using "LPA receptor-null" RH7777 and B103 cells exogenously expressing p2y5: [3H]-LPA binding, LPA-induced [(35)S]-GTPγS binding, Rho-dependent alternation of cellular morphology, and cyclic AMP accumulation via a Gs/13 chimeric protein. Consistently, LPA-induced contraction of human umbilical vein endothelial cells was suppressed by siRNA knockdown of endogenously expressed p2y5. I also found that 2-acyl-LPA had higher activity to p2y5 than 1-acyl-LPA.

In conclusion, I revealed that Rho is an important effector of LPA4, and p2y5 is a novel LPA receptor (LPA6), which activates the G(12/13)-Rho signaling pathways. These findings will help better understand the physiological and pathological roles of "non EDG" family LPA receptors.

本研究は多彩な生理機能を発揮する脂質メディエーターであるリゾホスファチジン酸(LPA)の受容体のうち、非EDG型LPA受容体群の機能を明らかにするため、LPA4の細胞内シグナル伝達の解析と新規LPA受容体の同定を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1. GPR23/p2y9/LPA4を安定発現させたラット神経芽腫細胞株B103細胞(B103-LPA4細胞)を樹立してその形態観察を行なったところ、血清存在下において細胞凝集が観察された。血清に豊富に存在するLPAによるLPA4の活性化がこの形態的特徴をもたらしていることが推察された。

2. LPA4の共役Gタンパク質を同定するために、Ca(2+)シグナルとcAMPシグナルについて検討したところ、LPA4はGqタンパク質には共役するがGs、Giタンパク質には共役しないことが明らかとなった。

3. 低密度で播種したB103-LPA4細胞を血清飢餓処理後にLPA刺激をしたところ、神経突起退縮が観察された。各種阻害剤の効果の検討により、この形態変化がG12/13-Rho経路の活性化によることが示唆された。

4. 高密度で播種したB103-LPA4細胞を血清飢餓処理後にLPA刺激をしたところ、血清存在下で同細胞が呈していたような細胞凝集塊の形成が観察された。この形態変化についてもG12/13-Rho経路の活性化によることが、各種阻害剤の効果の検討により示唆された。

5. B103-LPA4細胞で認められた細胞凝集における細胞間接着にカドヘリン、特にN-カドヘリンが関与することが、トリプシンを用いた細胞解離実験と免疫細胞化学実験により明らかとなった。

6. オーファン受容体p2y5を安定発現させたB103細胞株及びラット肝細胞腫細胞株RH7777細胞株において、LPA依存的な細胞形態の変化を認めた。この形態変化はROCK阻害剤により阻害されたため、p2y5がRho経路を活性化させるLPA受容体である可能性が示された。

7. p2y5を安定発現させたRH7777細胞株の膜画分を用い、トリチウムラベルされたLPAの結合を認めた。また、p2y5を介したGタンパク質、特にG13タンパク質のGDP/GTP交換反応がLPA刺激により亢進することをGTPγS結合実験と免疫沈降実験により明らかにした。

8. p2y5のLPAによる活性化をセカンドメッセンジャーの変化として検出することができた。すなわち、G13タンパク質とGsタンパク質とのキメラGタンパク質を作製し、これをp2y5を安定発現させたB103細胞に一過性に発現させたところ、LPA濃度依存的なcAMPの上昇を検出することができた。

9. GTPγS結合実験と上記キメラGタンパク質を用いたcAMP上昇検出系を用いて、グリセロール骨格のsn-2位に脂肪酸が結合したLPAつまり2-アシル型LPAの方が、1-アシル型LPAよりもp2y5のリガンドとして強いことを示した。

10. 内在性にp2y5を発現するヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)はLPA刺激により迅速な形態変化を引き起こした。この形態変化はp2y5に対するsiRNA処理により著しく減弱したため、p2y5依存的に起こることが示された。

以上、本論文は非EDG型LPA受容体であるLPA4がG12/13-Rho経路を活性化させる受容体であること、さらにオーファン受容体であったp2y5が同じくG12/13-Rho経路を活性化させる新規の非EDG型LPA受容体(LPA6)であることを明らかにした。本研究は多彩な機能を発揮するLPAの作用メカニズム解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。