<背景>

レニンーアンジオテンシンーアルドステロン系は高血圧を初めとする様々な病態を引き起こす原因となっている。アンジオテンシンII (Ang II)は強力な血管収縮作用を有し高血圧・動脈硬化などをもたらす。アルドステロン(Aldo)はAng IIの刺激により副腎皮質球状層で産生されナトリウム再吸収を促進し循環血漿量を増加させ高血圧の原因となる。近年MR拮抗薬であるスピロノラクトンやエプレレノン(Eplr)が心不全患者の生命予後改善効果をもたらすことが証明されたが、その機序を解析する過程において、MRが遠位尿細管のみならず、血管平滑筋を含め心血管系組織などの非上皮系組織にも広く分布し、AldoもAng IIと同様に催炎症作用や組織線維化などを介して直接心血管疾患の予後悪化に関与することが明らかになってきた。

オステオポンチン(OPN)は分泌型糖蛋白質で、近年動脈硬化巣近傍でOPN濃度が上昇していることが報告され、また各種細胞系でAldo刺激でのOPN転写活性亢進が報告された。原発性アルドステロン症患者において血圧が同程度の本態性高血圧患者よりもOPN血中濃度が有意に上昇していることが報告された。これらの報告からAldoの血管炎症惹起作用・動脈硬化進展作用の一部はOPNを介している可能性がある。

従ってAldoによる催炎症作用の詳細を検討するためには、OPN遺伝子転写活性亢進の細胞内機序の解明が重要であるが、動脈硬化進展において主要な標的細胞である血管平滑筋細胞に関して現在まで報告がない。また分泌されたOPN蛋白そのものの細胞に対する直接作用に関しても報告がない。そこでラット血管平滑筋細胞(rVSMC)におけるAldo刺激による細胞内OPN転写活性化機序、非ゲノム作用について検討する。さらにOPNのrVSMCに対する作用を検討する。

<方法>

OPN遺伝子転写活性に対するAldo刺激の用量依存性を確認するため、rVSMCを10-10~10-6Mの濃度で24時間刺激した。また時間依存性を確認するため10-6Mで1.5~24時間刺激した。total RNAを抽出しOPN mRNA発現量をquantitative RT-PCRにより解析した。選択的MR阻害薬であるEplrによるOPN転写活性化抑制効果確認のため、同様の実験を1時間10-5M Eplrで前処置した後に行った。

OPN promoter領域の転写活性化寄与領域を同定するためluciferase reporter assayによりpromoter deletion analysisを行った。全長OPN promoter (-2284)および5'側を転写開始部位から-1599, -1300, -795, -536としたdeleted promoterの10-7M Aldo刺激後のluciferase活性を測定した。

転写因子結合部位として目標とする範囲に存在するCREB(-1460から-1453)、GRE(-1404から-1386)およびGRE consensus配列(-1394から-1386)を欠損した配列を有するplasmidを作成し、luciferase活性を測定した。

electrophoretic-mobility shift assay (EMSA)により核抽出物の転写因子結合部位への結合を確認した。GRE配列および変異GRE配列のprobeを作成した。また各種刺激後のrVSMCの核抽出物を作成しEMSAを実施した。

Aldo刺激によるOPN遺伝子転写活性亢進における非ゲノム作用関与の有無を検討するためc-Srcおよびextracellular signal-regulated kinase (ERK) 1/2のリン酸化を観察した。rVSMCをAldo 10-7Mで10-120分刺激した。またc-Srcの選択的阻害剤であるPP2を10-5Mの濃度で30分間前処置後に同様の刺激を行った。それぞれ蛋白抽出しWestern blot法を用いた。

OPNのrVSMCに対する生理活性を検討するため、OPN siRNAを用いて発現抑制を試みた。

rat OPN蛋白のrVSMCに対する作用を確認するため、rat OPN蛋白を麹菌に遺伝子導入し合成しrVSMCを24時間刺激しWestern blot法により評価を行った。

<結果>

rVSMCに対する24時間のAldo刺激は用量依存的および時間依存的にOPN遺伝子転写を増加した。AldoによるOPN遺伝子転写活性化はEplr添加によって有意に減弱した。

deleted promoter assayにおいて-1599までの欠損promoterは完全長promoterと同等の活性化を認めたが(1.83±0.55倍、p=0.019)、-1300より短いdeleted promoterでは有意な活性化はみられなかった。転写因子結合部位として-1404にGREがあり、そのGREを完全に欠損したpromoterではAldo刺激による活性化はみられず、さらにGREのコンセンサス配列のみ欠損したpromoterも同様に活性化能を失っていた。同範囲内に存在するCREBを欠損しても活性化は抑制されなかった。

GREへのAldo-MR複合体の結合を確認するためEMSAを行った。10-7M Aldoにより24時間刺激を行った後の核抽出物と当該GRE配列を有するprobeと複合体を形成させると、非刺激のものに比し複合体バンドの増強が認められた。配列特異性を確認するためにcold probeを用いてcompetition assayを行ったところ、バンドの減弱を認めた。GREのコンセンサス配列を変異させたprobeを用いると複合体バンドは減弱した。10-7M Aldo24時間刺激の前に1時間の10-5M Eplr前処置を行うとバンドの減弱を認めた。またコルチコステロンの24時間刺激(10-5M)では複合体バンドの増強は起こらなかった。抗MR抗体を加えて複合体を形成させるとバンドはsuper shiftした。抗GR抗体ではsuper shiftは認めなかった。

Aldo短時間刺激によるc-SrcおよびERK1/2のリン酸化においては、10分から両者のリン酸化亢進を認めた。またPP2による前処置によって、c-Src, ERK1/2ともリン酸化が著明に阻害された。OPN蛋白は10-7M Aldo 2時間刺激で発現増加し、PP2による前処置で有意に抑制された。

OPN siRNAはAldoによる刺激がない場合はrVSMCにおけるOPN mRNAを抑制したが、Aldo刺激後には有意な抑制を認めなかった。

麹菌に遺伝子導入しHAタグ付きrat OPNを産生し、Anti-HA affinity Matrixを利用して精製した。このrat OPNを用いてrVSMCを刺激したところ、30分からc-Srcのリン酸化亢進を認め、90分まで時間依存性に増強した。

<考察>

Aldo刺激はOPN遺伝子転写活性を用量依存性・時間依存性に亢進した。これは他の細胞系の報告と一致した。

各種刺激におけるOPN転写活性亢進に関しては転写因子としてAP-1, NF-κBの関与を報告するものが多い。Aldo刺激に関する報告は少ないが、Iritaらはラット腎線維芽細胞に対するAldo刺激においてAP-1, NF-κBの関与を報告している。今回私はrVSMCでの検討を行ったが、現在までの報告と異なり、Aldo-MR複合体形成、さらには転写因子結合部位としてGREを介する経路が重要であることを証明した。

コルチコステロン刺激ではMR-DNA複合体形成の増強は起こらなかった。またsuper shift assayでは抗MR抗体のみがsuper shiftを引き起こし、抗GR抗体にはそのような変化が認められなかった。この結果より、rVSMCにおけるOPN遺伝子活性化機構にコルチコステロンの関与は少ないと考えられた。

Aldoの非ゲノム作用としてrVSMCにおいても10分からc-SrcおよびERK1/2のリン酸化亢進が認められ、30分で一旦減弱したものの再び60分以降リン酸化亢進が認められた。これらの亢進はPP2によって完全に抑制された。今回OPN蛋白にc-Srcのリン酸化能があることを示したが、蛋白レベルでのOPN産生亢進は2時間以内に開始していたため、60分以降のc-Srcリン酸化亢進に関しては比較的短時間のうちに産生が亢進されたOPN蛋白のautocrine/paracrine的作用である可能性が考えられた。

<結論>

AldoによるOPN遺伝子転写活性亢進は用量依存的・時間依存的であった。時間依存性は24時間にかけて単調増加であり、非ゲノム作用を示唆するような短時間の活性化は認めなかった。エプレレノンはAldoによる活性化をよく抑制し、機序としてMRを介していることが示唆された。Aldo-MR複合体は-1404に存在する特定のGREに結合し活性亢進をもたらすことが示唆された。抗MR抗体によるsuper shiftが認められ、GRE配列への結合はMRが直接関与していることが示された。rVSMCにおけるAldoによる非ゲノム作用ではc-SrcおよびERK1/2のリン酸化が10-20分および60分以降に認められc-Src系の関与が示された。60分以降の活性化に関してはAldo刺激による産生OPN蛋白自身のautocrine/paracrine作用によるものの関与の可能性が考えられた。

本研究は動脈硬化進展過程において重要な役割を演じていると考えられる血管平滑筋細胞におけるアルドステロン(Aldo)によるオステオポンチン(OPN)転写活性亢進機序を明らかにするため、ラット血管平滑筋細胞(rVSMC)を各種条件下でAldoにより刺激をし、種々の解析を行ったものであり、下記の結果を得ている。

1. rVSMCに対する24時間のAldo刺激は用量依存的および時間依存的にOPN遺伝子転写を増加した。AldoによるOPN遺伝子転写活性化はミネラロコルチコイド受容体(MR)拮抗薬であるエプレレノン(Eplr)添加によって有意に減弱した。

2. deleted promoter assayにおいて-1599までの欠損promoterは完全長promoterと同等の活性化を認めたが、-1300より短いdeleted promoterでは有意な活性化はみられなかった。転写因子結合部位として-1404にglucocorticoid response element (GRE)があり、そのGREを完全に欠損したpromoterではAldo刺激による活性化能を喪失していた。GREのコンセンサス部位のみを欠損しているpromoterにも活性化能はなかったが、同範囲内に存在するCREBを欠損しても活性化は抑制されなかった。

3. GREへのAldo-MR複合体の結合を確認するためEMSAを行った。10-7M Aldoにより24時間刺激を行った後の核抽出物と当該GRE配列を有するprobeと複合体を形成させると、非刺激のものに比し複合体バンドの増強が認められた。配列特異性を確認するためにcold probeを用いてcompetition assayを行ったところ、バンドの減弱を認めた。GRE配列を変異させたprobeを用いると複合体バンドは減弱した。10-7M Aldo24時間刺激の前に1時間の10-5M Eplr前処置を行うとバンドの減弱を認めた。コルチコステロンの24時間刺激では複合体バンドの増強は起こらなかった。抗MR抗体を加えて複合体を形成させるとバンドはsuper shiftした。抗GR抗体ではsuper shiftは認めなかった。

4. Aldo短時間刺激によるc-SrcおよびERK1/2のリン酸化においては、10分から両者のリン酸化亢進を認めた。またPP2による前処置によって、c-Src, ERK1/2ともリン酸化が著明に阻害された。OPN蛋白は10-7M Aldo 2時間刺激で発現増加し、PP2による前処置で有意に抑制された。

5. OPN siRNAはAldoによる刺激がない場合はrVSMCにおけるOPN mRNAを抑制したが、Aldo刺激後には有意な抑制を認めなかった。

6. 麹菌に遺伝子導入しHAタグ付きrat OPNを産生し、Anti-HA affinity Matrixを利用して精製した。このrat OPNを用いてrVSMCを刺激したところ、30分からc-Srcのリン酸化亢進を認め、90分まで時間依存性に増強した。

以上、本論文はラット平滑筋細胞においてAldoによるOPN遺伝子転写活性亢進機序の解析から、Aldo-MR複合体が特定のGREに結合し活性亢進をもたらすことが示唆された。またOPN蛋白自体のc-Src系活性化作用が示された。本研究によりOPNの血管炎症・動脈硬化進展作用機序が詳細に示され、将来的に抗OPN薬が抗動脈硬化薬としての作用を有し臨床応用できる可能性が考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。