1. Introduction

When the chondrocytes are isolated from the native cartilage and proliferate in vitro, they soon lose their original ability to express GAG and type II collagen, which is termed dedifferentiation, or decrease cell viability. As the dedifferentiated chondrocytes seemed sensitive to malnutrition or hypoxia, the larger tissue-engineered constructs containing the abundant dedifferentiated cells may worsen the central necrosis, and eventually lead to the deterioration of cartilage regeneration.

Therefore, we should induce the re-differentiation for the chondrocytes suffering from the dedifferentiation that inevitably occurs during the proliferation culture. The purposes of the present study were to increase the cell viability and the cartilage maturation of the tissue-engineered constructs by the optimization for the place or the timing in the administration of growth factors.

2. Methods

We firstly examined the in vitro cartilage regeneration of tissue-engineered pellets that consisted of human auricular chondrocytes and atelocollagen, and that were incubated in vitro under the stimulation with BMP-2, insulin and T3. We then examined the administration of those growth factors into the scaffold, instead of the medium, and explored the possibility that the atelocollagen, the hydrogel scaffold of chondrocytes, may work as drug delivery of the factors. Lastly, we investigated the timing and the duration of administration of growth factors on the 3D culture of the tissue-engineered cartilage.

3. Results and discussion

We measured the GAG contents in the pellets, in which BMP-2, insulin or T3 were placed into the medium or the atelocollagen hydrogel. We prepared 27 groups in which three factors (BMP-2, insulin and T3) were treated with 3 options (in the medium, in the atelocollagen gel, and no administration), and incubated those pellets for 3 weeks. In the 27 groups, we noticed that BMP-2 and insulin took the major role in the production of GAG. The six combination: BMP-2 and insulin in the atelocollagen; BMP-2 in the atelocollagen and insulin in the medium; insulin in the medium; BMP-2 and insulin in the medium; insulin and T3 hormone in the medium; BMP-2 in the atelocollagen, insulin and T3 hormone in the medium showed high GAG production. Especially, BMP-2 in the atelocollagen with the supplement of insulin in the medium could not only produce the higher GAG matrix in a shorter period but also sustain the cell viability with lower mortality. The insulin in the medium could better be administered only for 2 weeks, rather than 3 weeks, which would save the time and the economical cost and hence shortening the in vitro culture of chondrocytes. Our protocol of BMP-2 embedded within pellets with insulin supplement just shed a light on the strategy of making tissue-engineered cartilage with a larger size. In the clinical practice, the present size of the tissue-engineered cartilage in the conventional method has often been restricted to less than 1 mL, which indication was confined to focal cartilage defects. The tissue-engineered constructs with a larger size would broaden the indication range of the cartilage regenerative medicine.

本研究は、ヒト耳介軟骨細胞とアテロコラーゲンゲル足場素材を用いて作製した再生軟骨ペレットの培養において、成長因子の投与部位や投与時期を検討し、再生軟骨組織の成熟を促す培養法の確立を目指したものであり、以下の結果を得ている。

1. 再生軟骨ペレットの培養液に骨形成因子(BMP)-2、インスリン、甲状腺ホルモン(T3)を添加した場合、5 μLのペレットではglycosaminoglycans (GAG)の蓄積を認めたが、ペレットサイズを大きくすると良好なGAG産生は得られなかった。

2. インスリン投与部位の検討

(1) 再生軟骨ペレットの培養時にペレット内にインスリンを添加すると、軟骨細胞の生存性とGAG産生の増加を認めた。

(2) アテロコラーゲンゲルにインスリンを添加した場合、インスリンが経時的に培養液中へ徐放されることが明らかとなった。

(3) ヒト耳介軟骨細胞、ポリ乳酸足場素材およびアテロコラーゲンゲルで構築される再生軟骨組織をヌードマウスへ移植する際、ゲルにインスリンをあらかじめ添加しておくと、移植後の軟骨成熟が促進することが観察された。

3. 成長因子の組み合わせおよびその投与部位の検討

(1) 3種の成長因子(BMP-2、 インスリン、T3)を3通りの投与部位(培養液、アテロコラーゲンゲル、投与なし)と組み合わせ、合計27通りの培養法で再生軟骨ペレットを培養した。培養3週間後のGAG蓄積を検討したところ、アテロコラーゲンへ添加したT3はGAG産生を抑制することが明らかとなった。また、インスリンはその投与部位に関わらずGAG産生を促進する傾向を示した。

(2) 再生軟骨ペレット内の細胞生存性に関しては、T3が濃度依存的に細胞死を誘導した。

(3) 再生軟骨ペレットの培養に添加したインスリンは、BMP-2併用の有無に関わらずGAG産生を有意に増加させることが明らかとなった。また、BMP-2と高い相同性を有するとされるBMP-4は、GAG産生に関してBMP-2ほどの効果を発揮しなかったため、再生軟骨ペレットの培養時にBMP-4をBMP-2の代用に用いることは望ましくないことが推察された。

(4) 10 μL再生軟骨ペレットの培養においてBMP-2をペレットへ添加した場合、インスリンを併用するとT3の有無に関わらず良好なGAG産生がもたらされることが明らかとなった。同培養法では、ペレットサイズを20 μLまで増大させても良好なGAG産生が得られた。

(5) 培養液中へ添加したT3は、軟骨細胞の肥大化を抑制することが示された。

4. 成長因子の投与時期の検討

(1) 再生軟骨ペレットの培養初期において、インスリンが軟骨細胞の増殖ならびにGAG産生の促進に重要であることが示された。

(2) BMP-2をペレット内へ、インスリンを培養液中へ添加する組み合わせが、再生軟骨ペレットの培養2週で最も高いGAG蓄積を示した。この組み合わせを用いることにより、再生軟骨ペレットの培養期間を短縮させ、培養コストを削減することが可能になると考えられる。

以上、本論文はヒト再生軟骨組織の培養において、成長因子の種類、投与部位、投与時期に関する検討を行い、再生軟骨組織の成熟を効果的に促進し培養期間を短縮させる培養法を検討した。本研究は軟骨再生医療の発展に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。