Background: Bacterial native valve endocarditis (NVE) and prosthetic valve infective endocarditis (PVE) are potentially life-threatening clinical conditions that often associated with poor outcomes. Despite the recent advances in antimicrobial therapies and cardiac surgery techniques, the incidences of left-sided infective endocarditis (IE) and its fatal complications is still significantly high and Staphylococcus aureus remains the most common cause of the disease. Viable allografts (homografts) and autografts (isografts) are believed to maintain resistance to such infections, but the mechanism remains undetermined. In the previous experiments fresh vascular allografts suppressed methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) growth by the induction of an immune response and tryptophan metabolism via the indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) pathway. The use of fresh allografts is limited by short storage time and cryopreservation is the method of choice which allows to preserve tissue viability and integrity at good level. We studied both the impact of cryopreservation on the anti-infectious properties (e.g. anti-MRSA) and IDO expression of vascular allografts.

Methods: Brown Norway (BN) and Lewis (LEW) rats were used as allogeneic or syngeneic transplantation models. One centimeter of fresh or cryopreserved thoracic aortas were prepared from donor rats and transplanted into the recipient rats' abdominal aortas, below the kidney level. The grafts were recovered from recipient rats on days 7, 14 and 28 and submitted for gene expression analysis or for MRSA proliferation assay to determine the extent of the local immune-related and IDO gene expression and their bacteriostatic effect. The localization of IDO protein was studied using immunohistochemistry (IHC).

Results: Fresh and cryopreserved allografts significantly suppressed MRSA growth. IFNγ, TNFα gene expression on days 7, 14 and 28 was minimal in cryopreserved syngeneic grafts, and much higher in fresh allografts, but the iNOS gene expression in one week was higher in cryopreserved allografts than in fresh allografts. The expression of IDO on days 7 and 14 was higher in the fresh allografts in comparison to that of cryopreserved allografts, although the difference has diminished on day 28 after transplantation. Inhibition of IDO with 1-methyl-D-tryptophan significantly decreased the suppressive abilities of allografts. The IDO protein was detected in the intima and adventitia of allografts, where inflammatory cell infiltration was remarkable.

Conclusion: Cryopreservation does not diminish anti-infectious properties of allografts and both fresh and cryopreserved allografts suppressed MRSA proliferation significantly. During first two weeks after transplantation IDO expression in cryopreserved allografts was lower than in fresh allografts, but sufficient to support anti-MRSA resistance of allografts.

本論文は、凍結保存された血管組織(cryopreserved vascular allograft, homograft)がどのようなメカニズムで抗感染性を発現するのかを追及した研究である。心臓血管外科手術において感染性心内膜炎や、人工弁感染といった生命を脅かす重症感染症に対する代用材料(弁、血管)として、homograftの有用性が報告されているが、その抗感染性発現のメカニズムは明確に解明されていなかった。これまでの研究から新鮮血管組織移植においてIndoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)が発現することによりtryptophanがKynurenine pathwayによって代謝されて行き3-Hydroxykynurenineが生成され、この代謝産物が強い抗菌作用を有することが分かっている。そこで血管組織を凍結保存することでIDOの発現にどのような影響を及ぼすか、またそれによって抗感染性はどのような影響を受けるか、を検証し下記の結果を得ている。

1.ラットのBrown Norway種とLewis種を用いてそれぞれ胸部大動脈をdonorとしrecipientの腹部大動脈位に新鮮組織、凍結保存組織を同種移植した。術後7, 14, 28日後に移植片を取り出し遺伝子発現、methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)の抑制効果を評価した。

2.その結果、移植された新鮮組織も凍結保存組織も有意にMRSAの発育を抑制した。

3.Inducible nitric oxide synthase (iNOS)の遺伝子発現は7日後で有意に凍結保存組織で高かった。

4.IDOの遺伝子発現は7, 14日後で新鮮組織において有意に高かったが、28日後では新鮮組織のIDOの遺伝子発現は、凍結保存組織と有意差が消失するレベルまで低下していた。

5.1-methyl-D-tryptophan投与でIDOによるtryptophan代謝を抑制すると新鮮組織、凍結保存組織ともMRSA抑制効果は有意に低下した。

6.IDO蛋白は主に血管組織の内膜と外膜に検出された。

以上、本論文は血管組織は凍結保存することにより、新鮮な血管組織よりはIndoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)の発現は低下してしまうが、抗感染作用としては十分に温存されているレベルであることを明らかにした。

本研究はこれまで明確にされていなかった、凍結保存血管組織(homograft)の抗感染性を科学的に証明しており、学位の授与に値するものと考えられる。