RNA interference (RNAi) is a powerful regulatory mechanism of the target mRNA degradation induced by the complementary RNA strand. Because of the selectivity of the targeted mRNA degradation as well as the potential of silencing almost all the endogenous genes, small interfering RNA (siRNA) has been highlighted as an attractive choice for future cancer therapeutics. However, the in vivo therapeutic application of siRNA needs to fulfill some requirements to exert RNAi in the target cells. Naked siRNA should be protected from degradation by nucleases and remained in the bloodstream from clearance by the reticuloendothelial system (RES). The negative charge of the siRNA inhibits its interaction with negatively charged plasma membrane for the internalization into cells. Even though some portions of siRNAs could be internalized into cells, the internalized siRNA would be degraded in lysosome. Hence, the carrier system to protect siRNA from the external circumstances and to escape endosome efficiently before the lysosomal degradation would be required for effective siRNA therapeutics.

The material selection is important to design an efficient siRNA delivery carrier enabling to satisfy the requirements. Previously our laboratory reported that the cationic polyaspartamide derivative, poly{N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} (PAsp(DET)), possessed pH-sensitive endosome destabilizing activity. PAsp(DET) can destabilize the cellular membrane only at the endosomal pH and, thus, obtain a high endosomal escape ability. PAsp(DET)-based polyplexes with plasmid DNA have shown to have remarkable transfection efficiency without marked cytotoxicity in various cultured cells including a primary cell. However siRNA complex formed with PAsp(DET) did not have RNAi because the siRNA complex is unstable in cell culture condition and bloodstream and quickly dissociated into siRNA and the polymer.

To overcome this instability, stearic acid as a hydrophobic moiety was conjugated to the side chain of PAsp(DET) at a limited introduction ratio. Stearoyl introduction successfully contributed the formation of larger siRNA complex with higher association number in Chapter 2. Stearoyl PAsp(DET)/siRNA complexes tolerates the cell culture condition better than does unmodified PAsp(DET)/siRNA complex, allowing for improved cellular internalization. Stearoyl PAsp(DET) showed 50%-60% endogenous VEGF and BCL-2 gene suppression in Panc-1 cells, implying that the polymer had potential application for cancer therapy. This impressive endogenous gene suppression was explained by the enhanced cellular uptake obtained from stearoyl introduction, and also by more efficient endosomal escape ability of PAsp(DET) backbone structure.

Stearoyl moiety was also introduced into PEG-b-PAsp(DET) and PEG-SS-PAsp(DET) for systemic administration in Chapter 3. Stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)/siRNA complex was administrated intravenously in B16F10-Luc lung metastatic tumor and showed 50% luciferase gene suppression. The siRNA delivery of the polymer accumulated higher in the lung than stearoyl PEG-b-PAsp(DET), which could be the main reason of better luciferase gene suppression in the lung tumor. In addition, stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)/siRNA complex had longer blood circulation measured by in vivo confocal microscopy, suggesting that the polymer may also be an effective carrier to a subcutaneous tumor model. From precise analysis of images in the confocal observation, some of stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)/siRNA complex exerted aggregation at initial circulation period, resembling the behavior of stearoyl PAsp(DET)/siRNA complex even though the majority of the siRNA complex was not aggregated and uniformly flowed. This aggregation tendency of stearoyl PEG-SS-PAsp(DET) can be probably explained by rapid response of glutathione toward the disulfide bond of stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)/siRNA complex in the bloodstream or natural exchange reaction of disulfide bond during synthesis procedure and micelle formation.

A study was extended to therapeutic siRNA delivery in Chapter 4. EGFR gene was selected as a target gene to inhibit B16F10-Luc lung metastatic tumor. The most efficient sequence of EGFR siRNA was predicted by siRNA design tools and the sense and antisense strand were modified by 2´-OMe to eliminate the activation of innate immune response in the cells. Stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)/siRNA complex was administered intravenously into mouse bearing the lung metastatic tumor but unexpectedly showed no inhibition of the tumor, probably due to inefficient delivery of siRNA by the polymer or inappropriate selection of the target gene. Finally, the polymer was investigated its delivery ability to BxPC3 subcutaneous tumor and showed that some amount of siRNA successfully accumulated into the tumor in the preliminary experiment. This study shows that therapeutic siRNA delivery by stearoyl PEG-SS-PAsp(DET) was not successful yet. However, the polymer still has potential for the therapeutic siRNA delivery in other types of tumor and should be investigated as next research.

近年、標的mRNAを選択的に分解するRNAiをがん治療へ応用しようとする試みに期待が高まっている。がんを標的とし、全身投与によりRNAi活性を誘導するには、核酸分解酵素による分解および細網内皮系(RES)による取り込みを回避し、がん組織に集積、標的細胞に侵入し、エンドソームから速やかに細胞質に移行するという多くの段階を越えていかねばならない。現在それら生体内障壁を克服するsiRNA送達キャリアの開発が精力的に行われている。エンドソーム脱出機能を有するポリカチオンとしては、poly{N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} (PAsp(DET))が開発されてきており、これをsiRNAキャリアに展開することがこれまで試みられてきたが、生体環境下でのコンプレックスの安定性が十分ではないために、治療効果を得るに十分なRNAi活性を得るに至っていない。本論文は、siRNAキャリア用ポリカチオンとして有望なPAsp(DET)の側鎖に疎水性のstearoyl基を導入することで、コンプレックスの安定性を強化したキャリアを創製し、全身投与により肺転移がんに対する治療効果を得ることを目的とした研究をまとめたものであり、以下の5章からなる。

第1章は序論であり、siRNAによるがん治療について述べるとともに、siRNAキャリアに求められる材料学的特徴を述べている。治療へ展開する際の問題点および課題について、現在行われている臨床治験の現状とともに解説し、本研究の意義及び論点を明確としている。

第2章では、本研究で取り扱う疎水性基(stearoyl基)導入カチオン性高分子(stearoyl PAsp(DET))の合成法と、そのキャラクタリゼーション、in vitro遺伝子発現抑制について、疎水性基導入による効果を中心に検討している。物理化学的評価を通して疎水性基の導入により実際にsiRNAとポリカチオンとのコンプレックスが安定化されたことを示すとともに、細胞取り込みが増し、遺伝子発現抑制効果が飛躍的に高まることを示している。

第3章では、全身投与を目的とし、第2章で述べた疎水性基導入コンプレックスにジスルフィド結合を介してPEG鎖を導入した材料を設計し、そのキャラクタリゼーションをin vitroおよびin vivoで行っている。はじめにstearoyl PEG-PAsp(DET)およびstearoyl PEG-SS-PAsp(DET)の合成法およびそれらsiRNAコンプレックスの物性評価を行い、PEG化によってコンプレックスの表面電位が抑えられること、細胞毒性を抑制できることを確認している。さらにstearoyl PEG-SS-PAsp(DET)コンプレックスにおいては、還元環境でジスルフィド結合の解離に伴う脱PEG化を確認している。in vitroでの遺伝子発現抑制効果において、stearoyl PEG-PAsp(DET)は遺伝子発現抑制が見られないものの、stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)では遺伝子発現抑制が得られることを確認し、脱PEG化の効果として議論している。続いて、Luc発現肺転移モデルマウスに対し、全身投与での遺伝子発現抑制を検討しており、stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)ではLucの遺伝子発現が抑制されることを確認し、本系が全身投与で有効であることを示している。さらにコンプレックの血中動態をin vivo共焦点顕微鏡を用いて評価しており、血中濃度の経時変化について曲線下面積(Area Under Curve)を指標として評価した結果、stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)が最も高い値を示したことを述べている。一方で、本系は血中循環中において凝集体が観察されることを認めており、これは血中に存在するグルタチオンによりジスルフィド結合が開裂し、脱PEG化が一部進行した結果、血中成分との会合が起こったためと考察している。

第4章では第3章において有効性が示されたstearoyl PEG-SS-PAsp(DET)を用い、肺転移がんモデルに対し、治療用siRNAによる全身投与での制がん効果を検討している。治療用siRNAとしてEGFR(上皮細胞増殖因子レセプター)を標的に選択し、がん増殖抑制を検討したが有意ながん増殖抑制は見られなかったことを述べている。これはがん増殖抑制をするに十分なsiRNAが送達できなかったためか、あるいはEGFRはがん細胞にアポトーシスを十分に誘導出来なかったためであると考察している。一方で、膵臓がん皮下移植モデルに対しては、VEGF(血管内皮細胞増殖因子)siRNAにより、投与期間中にがん増殖抑制が確認され、stearoyl PEG-SS-PAsp(DET)/VEGF siRNAが膵臓がん治療に有効である可能性を認めている。

第5章の総括では2~4章で検討した内容を簡潔にまとめるとともに今後の展望について議論している。

以上のように本学位請求論文は、ポリカチオン側鎖に疎水性であるstearoyl基を導入し、コンプレックスの安定性を強化することで、細胞取り込みと遺伝子抑制効果が飛躍的に向上することを見出すとともに、PEG化による細胞取り込みと遺伝子抑制効果の低減というジレンマに対し、還元環境に応答して開裂するジスルフィド結合をPEG-ポリカチオン間に導入し、脱PEG化を誘起することで解決しうることを提示している。実際、PEG-SS-PAsp(DET)は低毒性化と遺伝子抑制効果を両立し、Luc発現肺転移モデルにおいて全身投与によりLuc発現抑制を確認するなど本システムの有効性を見出している。EGFRを標的とした治療用siRNAを用いた肺転移がん治療においては、有意ながん増殖抑制効果は見られなかったものの、一方でVEGFを標的としたsiRNAを用いることで、膵臓がん皮下移植モデルにおいてがん増殖抑制を確認している。これは今後標的遺伝子をさらに検討することで本系がsiRNAの全身投与によるがん治療において有効であることを示している。以上のように本研究は、高分子材料の精密合成技術に立脚して、未だ達成されていないsiRNAの全身投与システムの開発を行い、これまで不可能であった膵臓がんの抗血管新生療法が可能であることを動物実験を通じて明らかとしたものであり、マテリアル工学の分野において極めて秀逸であると判定される。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。