Gene therapy is gaining popularity as a promising strategy to treat many intractable diseases. Especially, with the understanding of the genetic basis of cancer, an entirely new approach to the treatment of cancer using gene transfer techniques has emerged. The understanding that tumor growth and metastasis are angiogenesis dependent processes increased the interest in targeting tumor vasculature in anticancer therapy. A gene therapy-mediated approach for the delivery of antiangiogenic agents has several advantages, including the potential for sustained expression.

Gene delivery is a multiple step approach which depends on the ability of a gene carrier to overcome several biological barriers and safely deliver the transgene to the target cells. Polymeric gene delivery systems, i.e., polyplexes, have been emerged as a safe alternative to the viral vectors to realize the potential of nucleic acids in clinics. Polyplex micelle formed through electrostatic interactions of PEG-polycation block copolymer and plasmid DNA represents a promising strategy for systemic nonviral gene delivery.

In this study, poly(ethylene glycol)-poly(L-lysine) (PEG-Plys) block copolymer was applied as a basic platform for formation of a polyplex micelle and was further optimized by increased molecular weight of PEG to enhance shielding effect and thus micelle stability in blood; disulfide crosslinked core which stabilizes micelle structure in the extracellular entity, while facilitating smooth release of the plasmid DNA in the intracellular reductive environment; and introduction of cyclic RGD ligand to the micelle surface for specific targeting of αvβ3 and αvβ5 integrin receptors, which are overexpressed on tumor angiogenic endothelial cells. The effects of these implementations on gene expression in vitro, blood circulation ability and tumor growth inhibition effect by plasmid DNA encoding an antiangiogenic agent in vivo were investigated.

Long PEG chain and moderate crosslinked density were found to increase micelle stability in blood while maintaining high transfection efficiency in vitro and revealing tumor growth inhibition effect in vivo. Cyclic RGD ligand on the micelle surface further increased its transfection efficiency in cells overexpressing αvβ3 and αvβ5 integrin receptors, as a result of receptor-mediated endocytosis and modified intracellular trafficking. Moreover, increased tumor-to-blood ratio was found for the RGD modified micelles.

Finally, the 15% disulfide crosslinked micelle with cyclic RGD ((c(RGDfK)-PEG-P(Lys-SH15)) loading plasmid DNA encoding the soluble form of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-1 (soluble fms-like tyrosine kinase-1: sFlt-1), as the VEGF inhibitor, was tested for its antiangiogenic effect in BxPC3 pancreatic adenocarcinoma tumor bearing mice. BxPC3 xenograft was selected as a model of hypovascular tumor with thick fibrotic tissue, on which standard chemotherapy has only limited effect due to the inaccessibility of the therapeutic agents to the cancer cells. Systemic administration of thus obtained micelle achieved significant inhibition of tumor growth up to day 18 and its antiangiogenic ability was confirmed by decreased vascular density of the tumor tissue compared to the control. Significant therapeutic activity of the c(RGDfK)-PEG-P(Lys-SH15) micelle was achieved by combined effect of increased tumor accumulation, interaction with endothelial cells and enhanced transfection efficiency as a result of receptor specific endocytosis.

In summary, the feasibility of the antiangiogenic gene therapy against an intractable fibrotic tumor was demonstrated by the micelle evaluated in this study. These results suggest that RGD targeted crosslinked polyplex micelles can be effective plasmid DNA carriers for antiangiogenic gene therapy.

遺伝子治療は、がんなどに代表される従来の方法では治療困難な疾患に対する治療法として、その実用化が期待されている。しかしながら、現在までに数多くの臨床治験が行われてきたものの、いまだ標準的治療法とは成り得ていない。その最大の要因は、安全かつ効率良く治療遺伝子を標的とする細胞の核内に導入する技術が確立されていないためである。例えばがんを標的とする場合、外科的手術では切除困難な腫瘍組織を治療するには、全身投与を介した遺伝子デリバリーが最も有効である。ここで従来のウイルスなどを用いた遺伝子キャリアは、免疫系に容易に補足されてしまい、腫瘍組織への到達効率は非常に低くなることが知られている。全身投与を介して腫瘍組織に治療遺伝子を運ぶためには、免疫系の補足を最小限に抑えつつ血液中を安定に循環し、腫瘍組織を効率的に認識するようなデリバリーシステムの開発が必要と考えられる。本論文では上記課題を解決するために、遺伝子キャリアの「生体内(血流中)での安定性」および「腫瘍組織認識能」に着目し、新たな非ウイルス型遺伝子キャリア材料の開発を行っている。具体的には、生体適合性の高いポリエチレングリコール(PEG)とポリリシン(PLys)のブロック共重合体とプラスミドDNA(pDNA)の間で形成されるポリイオンコンプレックス(PIC)ミセルを基盤とし、これに化学修飾を施すことによる高機能化を行っている。化学修飾としては「生体内での安定性」を向上させるためにミセル内核のジスルフィド架橋とPEG重合度の増大に取り組み、「腫瘍組織認識能」を賦与するために環状RGDペプチド(cRGD)をミセル表層へと導入している。以下に、各章ごとに対する審査結果の概要を述べる。

第一章の序論では、遺伝子キャリアとしてのPICミセルの特徴を記述すると共に、腫瘍組織の標的化とその治療に向けて必要とされる機能についてまとめている。腫瘍組織への集積には、enhanced permeability and retention (EPR)効果を利用した受動的ターゲティングとキャリアへのリガンド分子導入に立脚した能動的ターゲティングがあり、両者を組み合わせることの有効性を述べている。また、がんの遺伝子治療に向けては治療遺伝子の選択が肝要であることを説き、中でも腫瘍組織での血管新生阻害に基づく治療法である血管新生阻害遺伝子療法は、がん細胞そのものではなく、周囲の血管系細胞への遺伝子導入により治療効果が得られることから、有効性が非常に高いことを指摘している。本章では、がんの遺伝子治療実現に向け、治療遺伝子まで含めた合理的なキャリア材料設計指針を提案し、本研究の意義および妥当性を述べている。

第二章では、EPR効果を介した受動的ターゲティングを向上させるために、ミセルキャリアの構造を安定化すると共に、生体成分との非特異的相互作用を最小限に抑えることを目指した研究がまとめられている。すなわち、ミセルコアへのジスルフィド架橋導入とPEG重合度の増大を検討している。PEG重合度を12000ないし17000とし、PLysのリシン側鎖に対して種々の導入率のジスルフィド架橋型ミセルを調製し、粒子径などの物理化学的評価、培養細胞に対する遺伝子導入効率、蛍光ラベルpDNAを用いた血中滞留性評価、皮下移植膵臓癌モデルに対する血管新生阻害遺伝子療法など、非常に幅広い分野に渡る一連の評価を行っている。そして、ミセルキャリアの血中滞留性は、架橋導入率およびPEG重合度の増大に伴い向上することを実験的に明らかにしている。その一方で、過度な架橋導入は細胞内での遺伝子放出を妨げ、培養細胞への遺伝子導入効率を下げることを示している。それらの結果として、分子量17000のPEGを用い、かつジスルフィド基導入率15%のブロック共重合体から作成したミセルが皮下移植膵臓癌に対して最も高い抗腫瘍効果を有することを示し、架橋導入率の最適値が存在することをin vivo実験からも明らかにしている。

第三章では、腫瘍組織への選択性をさらに高めるために、上述のジスルフィド架橋型ミセルの表層(PEGの先端)にcRGDを導入し、その効果を検証している。cRGDに対する受容体であるαvβ3インテグリンを過剰発現した培養がん細胞に対する遺伝子導入実験においては、cRGDの導入により遺伝子導入効率が10倍以上増加することを示している。その理由として、ミセルキャリアの細胞内取り込みが増大することのみならず、細胞内動態までもが制御され、ミセルキャリアの核周辺への集積を加速させるという興味深い効果を挙げている。この加速効果は、PEG重合度の増大(12000から17000)に伴い増幅されることも明らかにし、その原因は、PEG重合度の増大により受容体を介さない細胞内取り込みが抑制されるためと考察している。さらに、皮下移植膵臓癌モデルに対する実験において、cRGDに基づく腫瘍組織、特に血管内皮細胞への集積性の向上を確認しており、結果として抗腫瘍効果の増強に成功している。同時に腫瘍血管密度の測定も行っており、得られた抗腫瘍効果は血管新生阻害に基づくことも検証している。

第四章では、総括として一連の研究のまとめと展望、そして今後さらに改善すべき遺伝子キャリアの課題についてまとめている。

以上、本論文では、PEG-PLys/pDNAから成るPICミセルのPEG重合度とジスルフィド架橋導入率の制御およびcRGD導入を通じて、「生体内での高い安定性」と「腫瘍組織認識能」を具備した遺伝子キャリアが構築されることを実験的に明らかにしている。また新たな遺伝子キャリア用材料を創製するだけでなく、物理化学的評価から細胞・動物実験に至る一連の実験を行い、最終的には難治性で知られる膵臓癌モデルに対する有意な治療効果を得ている。よって本論文の内容は、その緻密なアプローチや優れた有用性から考えて、バイオエンジニアリングの分野において卓越した価値を有しており、世界的にも実用化の機運が高まる非ウイルス型キャリアの開発に多大な貢献を与えるものと判断される。

よって本論文は博士(工学)の学位請求論文として合格と認められる。