In cellular signal transduction, information is encoded as temporal patterns of signaling molecules and is selectively transmitted and decoded by characteristics of the signal transduction pathways, leading to specific cellular responses. The Akt pathway plays evolutionary conserved roles in cell survival, growth and proliferation in response to growth factors. By recent advancements of molecular biology, knowledge about molecules which constitute the Akt pathway and its interactions is growing. However, dynamics and characteristics of signal propagation in the pathway, in other words, temporal activation patterns of molecules and their regulation mechanisms remain elusive.

Signal processing in the Akt pathway have been examined in this thesis by quantitative measurements of signaling dynamics, modeling, simulation, and employing frequency response analysis. Distinct dose-responses of S6 phosphorylation were experimentally found in PC12 cells in response to nerve growth factor (NGF) and epidermal growth factor (EGF). I also obtained counter-intuitive results indicating that the peak amplitudes of receptor and downstream phosphorylation are decoupled; weak sustained EGF receptor phosphorylation, rather than strong transient phosphorylation, strongly induced S6 phosphorylation, a downstream molecule of Akt. A developed phenomenological simulation model of the Akt pathway successfully reproduced the NGF- and EGF-induced dynamics observed in the experiment. In frequency response analysis, amplitude spectra were obtained by mapping the time courses of the model into frequency domain with Fourier transform, and the signal transfer efficiency was examined by using the ratio of downstream and upstream amplitude spectra. Using a frequency response analysis, I found that the Akt pathway exhibits a low-pass filter characteristic and that this characteristic of the Akt pathway can explain the convex dose response of S6 phosphorylation and decoupling effect of the peak amplitudes between receptor and downstream phosphorylation. Furthermore, I found that lapatinib, an EGFR inhibitor used as an anti-cancer drug, converted strong transient Akt phosphorylation into weak sustained Akt phosphorylation, leading to an even stronger S6 phosphorylation than in the absence of the inhibitor because of the low-pass filter characteristic of the Akt pathway. This indicates that the EGFR inhibitor can be a potential downstream activator. Because the low-pass filter characteristic is an intrinsic feature of biochemical reactions, our findings raise a caution in interpreting biological and pharmacological data without temporal information.

細胞の運命決定に関わるシグナル伝達経路は進化的に保存されており、その代表的な経路の一つがAkt経路である。近年の分子生物学の発展により、Akt経路を構成する分子は明らかになってきているが、経路を通るシグナルの動態やその制御は未解明の部分が多い。本論文はAkt経路の動態を計測し、シミュレーションモデルを併用することによりその制御機構を定量的に明らかにすることを目的としている。本論文では、Akt経路の動態の計測、シミュレーションモデルの構築と解析、周波数応答解析といった主に3つの手法で、この目的にアプローチしている。

1.Akt経路の動態の計測

NGF(神経成長因子)、EGF(上皮増殖因子)に対し、それぞれ増殖と神経様分化といった異なる細胞運命を辿ることが知られているPC12細胞を用いてAkt経路の動態を計測した。Akt経路はNGF、EGFによって活性化され、受容体、Akt、Aktの下流の分子S6のリン酸化の時間波形を計測した。その結果、下流にシグナルが伝わるほど、一過性の成分が減衰し、持続性の成分が増強される点が観察された。また、NGFの投与濃度に対して刺激後30分、60分のS6のリン酸化量は単調増加であるのに対し、EGFの投与濃度に対しては1ng/mLの濃度で最大のリン酸化量を示す山形のドーズレスポンスが観察された。さらにEGF刺激時には、受容体と下流のリン酸化の強度の大小関係が逆転していることを発見した。

2.シミュレーションモデルの構築と周波数応答解析

次に、Akt経路を単純化したモデルを作成し、進化的プログラミング、LM法を用いてパラメータを推定し、計測結果を再現するシミュレーションモデルを構築した。

系の特性を調べるために周波数応答を解析することは工学分野では一般的な手法である。工学分野ではサイン波を入力として系の応答を調べるが、生物の実験でサイン波を作り出すことは困難である。そこで、本研究ではシミュレーションの時間波形をフーリエ変換によりサイン波に分解し、経路の上流と下流の分子の時間波形から得たサイン波の振幅の比を得ることで、周波数成分ごとのシグナルの伝達効率を求めている。この結果、Akt経路は直列のローパスフィルタであることが示された。また、経路のカットオフ周波数で周波数帯域を分割し、逆フーリエ変換することにより、時間波形を低・中・高周波数成分に分割して示した。この結果、経路に伝わるシグナルの高周波成分は減衰し、低周波成分が増強されることが示された。Akt経路のローパスフィルタ特性により、受容体と下流のリン酸化の強度の大小関係が逆転していることが分かった。

3.Akt経路のローパスフィルタ特性の検証

Akt経路のローパスフィルタ特性によって、Aktの見た目のシグナルの強度は下がっても、下流のS6のリン酸化は大きくなることがあるという仮説を導いた。この仮説を検証するため、学位申請者はEGFRの阻害剤の作用機序を含めたモデルを作り、パラメータによっては仮説通りの挙動が生じることを確認した。さらに実験によって我々は実際に、阻害剤が無い時よりも、ある程度の濃度ある時の方がAktの下流のS6のリン酸化が増大することを確認し、Akt経路のローパスフィルタ特性を検証した。

なお、本論文は豊島有氏、宇田新介氏、尾崎裕一氏、久保田浩之氏、黒田真也氏との共同研究であるが、論文提出者が主体となって研究を立案・実行したもので、論文提出者の寄与が十分であると判断する。したがって、博士(科学)の学位を授与できると認める。