Background:

Silkworm (Bombyx mori) muscle contraction assay is a newly established method in my laboratory for quantitative measurement of innate immunity stimulation (1). In this system, stimulants of innate immunity such as cell wall components (peptidoglycan or B-glucan) of pathogenic microorganisms triggers activation of hemocytes, immune cells in insect hemolymph. Activated hemocytes produce reactive oxygen species (ROS), resulting in the activation of a serine protease in hemolymph followed by conversion of the precursor of paralytic peptide to the active form. The active form of paralytic peptide induces not only stimulation of immune responses, but also muscle contraction. By using this system, screened innate immunity stimulants from extracts of different plants. I found that hot water extracts of green tea (Camelia sinensis) and broccoli (Brassica olereceae italica) showed high activity. Here I describe purification of the active substances from those materials.

Experimental Procedures:

Assay of innate immunity stimulants

Muscle contraction values (C) were calculated by subtracting the final length (y) from the initial length (x) divided by initial length (figure 1). When an innate immunity stimulant is injected into hemolymph of silkworm muscle specimen, the immune cells are activated resulting in muscle contraction (1).

Sugar composition analysis

Monosachharide analysis was carried out by subjecting the polysaccharide to acid hydrolysis with 4M trifluoroacetic acid to convert polysaccharides to monosaccharides. The resultingmonosaccharides were labeled by aminobenzoic acid ethyl ester-methanesulfonate and analyzed by Reverse Phase-HPLC (RP-HPLC). 1D NMR spectrdscopic analysis was performed.

Purification of aninnate immunity stimulant from green tea

An innate immunity stimulant from green tea was purified with the following steps: hot water extraction, ethanol precipitation, 1st DEAE-cellulose chromatography at PH 7.9, 2nd DEAE-cellulose chromatography at pH 5.6, 1st MonoQ chromatography at pH 7.9, 2nd MonoQ chromatography at pH 5.6 and gel filtration with superdex 200.

Purification of an innate immunity stimulant from broccoli

A water-soluble and heat stable innate immunity stimulant was purified from broccoli.Purification was started with hot water extraction. Freeze-dried extract was treated with 67% ethanol. Resulting precipitates were dissolved in a buffer and fractionated by gel filtration with Sepharose CL-4B and Superdex 200.

Interleukin-6 (IL-6) production by mouse macrophage

The peritoneal macrophages were harvested 3 days after injection of 4% thioglycollate medium from C57BL/6 male mice. The cells were incubated for 24 hours with different concentrations of purified fractions from green tea and broccoli. E. coil Lipopolysaccharide (LPS) was used as a positive control. The amount of IL-6 was determined by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Student's t-test was used as statistical tool.

Results:

An innate immunity stimulant purified from green tea

The purified active substance was eluted earlier than the elution of B -lactoglobulin (35 kDa) in gel filtration, suggesting that its molecular mass was greater than 35 kDa. Green tea polyphenols [catechin and polyphenon], which have been.reported to modulate immunity (2), did not induce muscle contraction in the system of silkworms. Neither plant cellulose nor chitin did induce the contraction. The final fraction purified from green tea induced the production of IL-6 from mouse proinflammatory macrophage cells (figure 2). The amount of green tea polysaccharide needed for IL-6 production by mouse macrophage cells was much greater than that of LPS, that means the specific activity of immune stimulating polysaccharide purified from green tea is much less than that of LPS.

The activity of the purified fraction was lost by acid hydrolysis.

Sugar composition analysis of acid hydrolyzed samples by RP-HPLC and NMR analysis of purified fractions show that the purified substances were polygalactouronic acids. The NMR analysis data also showed that some of the carboxylic residues were methyl estered.

An innate immunity stimulant purified from broccoli

The active substance of broccoli was eluted earlier than the elution of Aprotinin (6511 Da) in gel filtration suggesting that the molecular mass of the active substance was greaterthan 6.5 kDa. The acid hydrolysis of final fraction lost the activity, suggesting that the purified materials were polysaccharides. The broccoli final fractions induced the production of significant amount of IL-6 from murine macrophage cells (figure 3). This result suggests that the broccoli innate immunity stimulant purified by silkworm muscle contraction assay induces innate immunity in mammals.

Discucussion:

I have established purification of novel innate immunity stimulants from green tea and broccoli. This is the first report for purification of immune stimulants from plants by using silkworm muscle contraction assay. These substances induced IL-6 production by mouse macrophage cells. Since specific activity of the fractions for IL-6 production is much less than that of LPS, I propose that the mechanism of stimulation of innate immunity by those polysaccharides might be different from that of LPS.

Figure 1: Silkworm muscle contraction by injection of an innate immunity stimulant

Figure 2: IL-6 production by mouse macrophage cells stimulated with compounds from green tea The error bars show the standard (n=3).(* p,<0.05 compared with saline)

Figure 3: IL-6 production by mouse peritoneal macrophage cells stimulated with purified compound from broccoli

The error bars show the standard deviations (n=3).(* p,<0.05 compared with saline)

論文提出者サファラ・ディタルの研究は、緑茶及びブロッコリーの熱水抽出画分に見いだされた自然免疫活性物質の精製、構造解析、並びに、精製標品によるマウス腹腔マクロファージの活性化に関するものである。

論文提出者は、自らが所属する研究室で開発された、カイコの筋肉収縮を指標とした自然免疫活性化物質の評価系に着目した(Ishii et al.(2008)J.Biol.Chem.283,2185)。この系では、カイコの血液内にβグルカンやペプチドグリカンのような真菌や細菌の外壁成分物質を注射すると、血液内に存在する免疫担当細胞が活性化して活性酸素種が生成される。それにより、血液内のセリンプロテアーゼが活性化され、麻痺ペプチドと呼ばれるサイトカイン様ペプチドが前駆体から切り出される。その結果、活性化麻痺ペプチドによる筋肉収縮が起きる。この系の特徴は、グラム陰性細菌の外壁構造であるLPS(リポポリサッカライド)が反応を示さないことである。大腸菌などのグラム陰性細菌は環境中に常在すること,並びに、マクロファージなどの細胞を用いた自然免疫活性化物質測定系において、LPSは極めて微量で反応する。そのため、LPSの混入は従来自然免疫活性化物質の評価を行う上で解決することが困難な問題であった。論文提出者は、カイコの筋肉収縮系を利用することにより、食品中に含まれる自然免疫活性化物質の活性を、LPSの混入の問題を無視して定量し、活性物質を精製することが可能であると考え、本研究に着手した。

論文提出者は、カイコの筋肉収縮系を用いて、種々の野菜や食品中に含まれる自然免疫活性化物質を検索した。その結果、緑茶とブロッコリーの熱水抽出液に高い活性が含まれることを見いだした。緑茶の活性物質については、エタノール沈殿並びにDEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー、MonoQカラムクロマトグラフィーにより、比活性の上昇を指標とした精製が行われた。その結果、再クロマトグラフィーを繰り返しても、比活性が上昇せず、またクロマトグラフィーにおける、活性と酸加水分解物に含まれる糖の挙動が一致することが判明した。そこで論文提出者は、活性物質が多糖として精製されたと判断するに至った。

さらに論文提出者は、精製された画分について、酸加水分解物中の糖の分析、並びに、lH並びに13CNMRによる解析を実施し、ケミカルシフトのパターンが既にペクチンとして報告されている、α-1,4ポリガラクツウロン酸及びそのメチルエステル体とよく一致していることを明らかにした。さらに論文提出者は、精製標品をβグルカナーゼ処理すると活性が消失すること,並びに、この酵素処理により大部分の構造が保持されることを示唆する結果を得た。このことから論文提出者は、βグルカナーゼ感受性の構造が活性に必要であること示唆した。

また論文提出者は、ブロッコリーの熱水抽出液中にも自然免疫促進活性があること、並びに、活性化物質がエタノール沈殿及びゲル濾過により精製されることを示した。したがって、緑茶の成分と同様、ブロッコリーの熱水抽出液中の活性物質も、多糖であることが示唆された。

さらに論文提出者は、緑茶やブロッコリーから精製した自然免疫活性化物質がマウスの腹腔マクロファージにおけるサイトカインIL-6の産生を促進するかについて検討した。その結果、緑茶やブロッコリー由来の多糖は、LPSに比べると非常に比活性は低いが、自然免疫活性化を示すことを明らかにした。この結果は、カイコの自然免疫活性化物質として精製された緑茶及びブロッコリー由来の成分が、ほ乳動物の免疫系も促進することを示唆している。

以上、論文提出者の研究は、免疫学、生化学に寄与するところが多く、当審査会は、論文提出者に対して、博士(薬学)の学位を授与するにふさわしい、と判定した。