[Background and Object]

Accumulated clinical evidences indicated that a wide variety of drug transporters as well as metabolic enzymes dominate the pharmacokinetics of drugs in humans, and the expression and function of these molecules are often variable among individuals, resulting in the altered drug concentration and drug response. Generally, the inter-individual difference in the expression and function of these molecules is caused by both genetic factors such as single nucleotide polymorphisms (SNPs) and non-genetic factors such as gender, age, environmental exposure and so on. It is commonly accepted that the functions of metabolic enzymes and transporters still show large inter-individual variation even from the same genetic background. Thus, in vivo phenotyping of transporters and enzymes using specific probe substrates or inhibitors for each molecule is one of the powerful approaches to know the quantitative function of pharmacokinetics-related molecules in an individual person. It is also possible to evaluate the quantitative impact of the function of each molecule on the pharmacokinetics of drugs and search for the important molecular targets for drug-drug interaction. For that phenotyping, specific probe substrates and inhibitors for each metabolic enzyme and transporter, which can be clinically applicable to humans, are needed. In the field of CYP enzymes, probe drugs for each CYP enzyme have been established and simultaneous administration of different probe drugs ("cocktail approach") enables us to quantify the metabolic activity of multiple CYP enzymes at one time. However, as for membrane transporters, though the importance of drug transporter in the drug disposition and elimination in the process of drug discovery and development and the strategies for evaluating the quantitative functions of drug transporters and the extent of drug-drug interaction mediated by transporters have been extensively discussed in the "FDA recent whitepaper on drug transporters" (1), no appropriate method for evaluating the in vivo function of multiple transporters important for pharmacokinetics of drugs has established at the moment. Kidney is one of the important organs for the detoxification of xenobiotics including drugs. Recent reports suggested that some membrane transporters are involved in the active tubular secretion and reabsorption processes. Basolateral organic anion transporter (OAT) 1 and OAT3, with broad substrate specificities, are considered to be responsible for the renal uptake of organic anions and the knockout of OAT1 or OAT3 decreased the renal clearance of some drugs, such as furosemide and benzylpenicillin in mice. Therefore, the purpose of my study is to establish and validate the appropriate candidates of human in vivo probe drugs and specific inhibitors for OAT1 and OAT3 by integrating the results of in vitro study and human clinical drug interaction study.

[Methods and Results]

As candidates of probe drugs for renal uptake transporters in humans, adefovir and benzylpenicillin (PCG) were selected as specific substrates for OAT1 and OAT3, respectively. Moreover, p-aminohippurate (PAH) was used as a specific inhibitor for OAT1 and probenecid as a potent inhibitor for both OAT1 and OAT3 (Fig. 1). The substrate specificities of probe substrates (adefovir and PCG) and the inhibitory effects of PAH and probenecid on their uptake were evaluated in transporter expression systems and human kidney slices. Furthermore, a human clinical drug interaction study was performed to observe the effects of the coadministration of PAH and probenecid on the pharmacokinetics of adefovir and PCG in healthy volunteers.

1.The specific recognition of candidates of probe substrates and inhibitors in in vitro studies

Adefovir and PCG are specifically taken up into OAT1- and OAT3-expressing HEK293 cells, respectively, suggesting that these compounds can be used as specific substrates of OAT1 and OAT3. Probenecid can potently inhibit the uptake of both adefovir and PCG with the Ki values of 12.6 and 3.00μM in human kidney slices, respectively (Fig. 2). In contrast, PAH preferentially inhibited OAT1-mediated adefovir uptake (18.6μM, Fig. 2A) rather than OAT3-mediated PCG uptake (499μM, Fig. 2B), indicating that an appropriate concentration of PAH can be used as a specific inhibitor for OAT1 in the clinical situation.

2.Pharmacokinetics of adefovir and PCG in Oat1 and Oat3 knockout mice

An in vivo study using Oat1 and Oat3 knockout mice was carried out to compare the renal clearance of adefovir and PCG in wild type and knockout mice. After intravenous administration of adefovir in Oat1 knockout mice, its plasma concentration was significantly increased and renal clearance was decreased to half compared with wild type mice. By subtracting glomerular filtration clearance from renal clearance, its secretion clearance was estimated to be almost nothing in Oat1 knockout mice. These results indicated that Oat1 plays an important role in the tubular secretion of adefovir. Mr. Kodaira in our laboratory previously demonstrated that the total clearance of PCG was decreased to 40.5% and its renal secretion clearance also decreased, even lower than the glomerular filtration clearance in Oat3 knockout mice compared with wild type mice. From these results, Oat3 largely contributes to the renal secretion of PCG and significant reabsorption mechanism of PCG existed in Oat3 knockout mice.

Therefore, it is suggested that Oat1 and Oat3 are important to determine the in vivo renal clearance of adefovir and PCG, respectively, which supports our in vitro results.

3.Clinical drug interaction study between probe drugs for OAT1 and OAT3 (adefovir and PCG) and inhibitors (PAH and probenecid) in healthy volunteers

This study protocol was approved by the ethics committees of both the faculty of pharmaceutical sciences in the University of Tokyo and Kitasato University East Hospital. 24 healthy male volunteers were randomly divided into four groups and 6 subjects in each group were treated with one of 4 combinations of substrates (adefovir or PCG) and inhibitors (PAH or probenecid). Three different doses of inhibitors (PAH or probenecid) were coadministered with probe substrates (adefovir or PCG) to each subject. The renal clearance of adefovir was decreased (50~83% and 48~71% of control) by both probenecid and PAH in a dose-dependent manner, respectively as we expected from the results of in vitro inhibition assays. In the case of PCG as a substrate, its renal clearance was decreased (24~53% of control) by probenecid, but contrary to our expectation, coadministration of PAH increased the renal clearance of PCG. This phenomenon may be explained by the inhibition of reabsorption process of PCG.

4.Possible mechanism for the tubular reabsorption of PCG

Up to now, although not well characterized, some apical membrane transporters expressed in renal tubular epithelial cells are considered to be involved in the renal reabsorption of compounds. To further characterize the underlined mechanism of the inhibitory effect of PAH on the reabsorption of PCG, in vitro uptake study of PCG in gene expression systems was performed. The significant uptake of PCG could also be observed in human OAT4-expressing MDCK cells and inhibited by both probenecid and PAH with Ki values of 56μM and 11mM, respectively. In the clinical study, at the high dose of inhibitors, the average unbound plasma concentration of probenecid and PAH was 56μM and 827μM, respectively. At present, there is no good method to accurately estimate the real concentration of inhibitor at the vicinity of transporters. If the reabsorption of PCG mainly occurs in the proximal tubule, and assuming that urine concentration of drugs at the proximal tubule is estimated to be 3.3-fold higher than their plasma concentration according to the literature information, the maximum concentration of PAH in the primitive urine was estimated to be about 2.7mM in phase 4, which is smaller than the Ki value for OAT4 (11mM). From this point, PAH could not strongly inhibit OAT4 function under the condition of my clinical study and we cannot conclude whether OAT4 partly contributes to the reabsorption of PCG in vivo. Another candidate transporter for reabsorption, URAT1 did not transport PCG into its expression system in a normal condition, suggesting that URAT1 is not involved in the reabsorption of PCG.

[Discussion and Conclusion]

Taking all the results into consideration, as we expected from the in vitro study, adefovir can be used as a probe drug for estimating the in vivo function of OAT1. PCG can be used as a probe drug for OAT3 only in its renal basolateral uptake process, while in our clinical drug interaction study between PAH and PCG, PAH increased renal clearance of PCG due to the possible inhibition of its reabsorption. So it was suggested that the renal clearance of PCG was affected not only by OAT3 but also by undefined reabsorption mechanisms. Thus, a special attention for reabsorption should be taken to consider the pharmacokinetics of PCG. It is also important to further clarify the exact mechanisms of renal reabsorption of drugs and to establish the methods for quantitative prediction of the impact of reabsorption on the overall renal clearance, which will help us the appropriate selection of OAT3 probe drugs. Previous reports indicated that large inter-individual variability of mRNA expression of OAT1 and OAT3 was observed in humans, though the frequencies of their genetic polymorphisms are very rare. Thus, using probe drugs, we expect that the inter-individual variation of the in vivo transport function of OAT1 and OAT3 could be estimated just by measuring the blood and urine concentration of probe substrates. Also, in the process of drug development, probe substrates have a great potential to be a useful tool to help the detection of clinically important drug-drug interactions in humans.

[Acknowledgement] I am grateful to Gilead Science Inc. for their kindly providing us with adefovir. I would also like to thank Dr. Tsunenori Kondo (Tokyo Women's Medical University) for the provision of human kidney slices for our studies and Dr. Yuji Kumagai (Kitasato University East Hospital) with his medical staffs and volunteers for the great contribution to our clinical study.

Fig.1 Candidate probe drugs and specific inhibitors for OAT1 and OAT3

Fig. 2 Inhibitory effects of PAH and probenecid on the renal uptake of adefovir (A) and PCG (B) in human kidney slices

Fig. 3 Summary for the effects of inhibitors (PAH and probenecid) on the uptake of probe substrates (adefovir and PCG)

一般的に、薬物の解毒に関与する主な臓器としては、肝臓と腎臓が挙げられるが、それぞれにおける解毒能力は、種々の薬物代謝酵素ならびに薬物トランスポーターの協調的な機能の総体として決定される。これまで代謝酵素については、数多くの遺伝子多型および薬物間相互作用と薬物動態との関連が臨床研究を通じて明らかにされてきた。近年、薬物トランスポーターについても、遺伝子多型と薬物動態の関連や、トランスポーターを介した薬物間相互作用を実証するための種々のヒト臨床試験によって、薬物動態を決定付ける要因としての重要性が認知されつつある。最近では、米国FDAを中心としたInternational Transporter Consortiumにより、Nature Reviews Drug Discoveryに「トランスポーター白書」と位置付けられる総説が発表されており、創薬プロセスの中で薬物相互作用試験の必要性の有無を判断するdecision treeの提案などがされており、創薬の上で考慮すべき必要不可欠な因子の1つになっている。

これら分子の機能・発現の個人差は、薬物動態の個人差を生み出す要因として重要であることはいうまでもない。これまで、遺伝子多型によりヒトを層別化することで、薬物動態の個人差の原因の一部を説明しうることが明らかにされてきている。しかしながら、同じ遺伝子型の群内においても依然として大きな個人差が見られるケースが多い。この原因の1つとして、薬物代謝酵素・トランスポーターの発現量の個人差が考えうる。例えば、種々の転写因子を介して、喫煙や食品中に含まれる物質など種々の環境要因や病態・年齢など様々な要因によりmRNA発現量が制御されることが知られている。非遺伝的要因による発現量の個人差を調べるためには、臓器をサンプリングして発現量を直接測定するしか方法がなく、ヒトにおいては適用が不可能である。従って、ヒトin vivoの状態での各分子の機能を、現実的に可能な低侵襲条件下でフェノタイピングできる方法論の開発が切望されている。

代謝酵素の領域においては、個々のCYPについて分子種選択的な基質および阻害剤が同定されており、かつヒトにおいて臨床で投与可能な薬物群が知られている。さらに、ヒトに個々の代謝酵素の機能を反映する複数のプローブ薬を同時にカクテル投与した後、尿中に出現するそれぞれの代謝物の量を測定することで、ヒトにおける複数の代謝酵素の機能を一度にフェノタイピングすることも可能となっている。しかしながら、薬物トランスポーターについては、個々の取り込み・排出トランスポーター機能を反映した体内動態を示す選択的基質・阻害剤でかつヒトに臨床で投与可能な薬物群の探索は進んでおらず、ヒトin vivoでフェノタイピングするための手段がないのが現状である。

ヒト腎臓においては、血管側にorganic anion transporter (OAT)1, OAT3と呼ばれる基質多選択的なトランスポーターが発現しており、有機アニオンの血液側から腎細胞への取込みを担う重要な役割を担っていることが明らかとなっている。過去の検討から、トランスポーター基質について、トランスポーターによる取り込みが、腎クリアランス全体の律速段階になっているケースが多いことが想定されている。OAT類は、頻度の高い遺伝子多型がほとんど存在しない一方で、ヒト腎臓におけるOAT類のmRNA発現量には大きな個人差があるという報告もされていることから、in vivoフェノタイピングによる機能評価は、腎クリアランスの個人差を考慮する上で有効な手段になりうると考えた。

そこで本研究では、ヒト腎臓のOAT1, OAT3の機能をヒトin vivoでフェノタイピングすることを目的として、それぞれのトランスポーターに対する選択的基質および選択的阻害剤となり、かつヒト臨床で適用可能な薬物をin vitro実験や動物実験により探索すると共に、ヒト臨床研究を通じて、その妥当性について評価することを試みた。

1. in vitro実験によるOAT1, OAT3選択的プローブ基質・阻害剤の選択性の検証

ヒト臨床において適用可能なOAT1, OAT3の選択的基質となるプローブ基質薬物の候補としてadefovir, PCGがそれぞれ用いうるかについて、OAT1, OAT3発現HEK293細胞を用いた取込み実験を行った。その結果、adefovir, PCGは、それぞれOAT1, OAT3を介した輸送のみが観察され、選択的な基質であることが示唆された。またヒト臨床研究において用いる阻害剤として、OAT1の選択的阻害剤の候補としてPAHが考えうるが、OAT3の選択的阻害剤については、ヒト臨床での適用を考慮した場合見つけられなかったため、OAT1, OAT3両方に対して強い阻害能を示すprobenecidを次の臨床研究では用いることを考えた。PAHのOAT1, OAT3に対する阻害定数(Ki)は、それぞれ6.47±1.51μM、142±27μMとなり、PAHは、低濃度でOAT1選択的な阻害をかけうることが示された。一方で、probenecidのOAT1, OAT3に対するKi値は、それぞれ3.99±0.80μM、3.53±0.73μMとなり、OAT1, OAT3ほぼ同程度の阻害能で阻害することが明らかとなった。ヒト腎スライスを用いた、プローブ基質の取込みに対するPAH, probenecidの阻害効果について検討を行ったところ、adefovirの取り込みに対して、PAH, probenecidによる阻害強度はほぼ同じであったが、PCGの取込みに対するPAH, probenecidのKi値は、それぞれ499±226μM, 3.00±0.61μMとなり、PAHの方がprobenecidと比較してはるかに阻害能が弱いことが示された。これらの結果から、ヒト腎臓において、adefovir, PCGがOAT1, OAT3選択的プローブとなりうることが示唆された。

2. OAT1, OAT3のプローブ薬としてのadefovir, PCGの利用に関する妥当性検証のためのヒト臨床研究

adefovir, PCGがそれぞれOAT1, OAT3の選択的基質薬物となること、またPAH, probenecidが、OAT1選択的ならびにOAT1, OAT3両方の阻害剤となることが示されたことから、ヒトin vivoでもプローブ基質・阻害剤として用いうるかについて検証するため、ヒト臨床研究を行った。健常人ボランティア24名を4群に分けてadefovir,もしくはPCGと、PAHもしくはprobenecidを併用投与したときのadefovir, PCGの血中濃度推移の変動を観察した。その結果、adefovirを基質薬物として投与した群については、PAH, probenecid共に阻害剤の投与量依存的に血漿中AUCの上昇が確認された。従って、in vitro試験からの予想通り、adefovirは、OAT1選択的なプローブ薬物として用いうる可能性が考えられた。一方、PCGを基質薬物として投与した群については、probenecidについては、投与量依存的な血漿中AUCの上昇が認められたが、予想に反して、PAHと併用投与した場合においては、PCGの血漿中AUCが減少した。この結果から、probenecidは、PCGの腎取り込み過程を阻害するものの、PAHは、OAT3を介した輸送で腎へ取り込まれるPCGの輸送を阻害せず、逆に再吸収過程を阻害した結果、腎クリアランスが上昇したことが推察された。

3. PCGの腎再吸収メカニズムに関するin vitro実験による検討

PAHにより阻害ざれるPCGの腎再吸収メカニズムを探るべく、in vitro実験を行った。腎臓のapical側に存在するトランスポーターは複数同定されてはいるものの、薬物の再吸収に関わることが明確に示されているものはほとんどない。そこで候補として腎臓apical側に発現が確認されているOAT4とURAT1に着目し、発現細胞を用いた検討を行った。その結果、PCGはURAT1の基質にはならないが、OAT4の基質となることが明らかとなった。また、PAHはOAT4を介したPCGの輸送を阻害したことから、PCGがOAT4により再吸収され、PAHにより阻害で再吸収が低下した結果、予期せぬクリアランスの上昇につながった可能性が推察された。但し正確にPAHの近位尿細管中の濃度を推定するのが困難であることから、OAT4が腎再吸収メカニズムであると断定するにはさらなる検討が必要であると考えられた。

以上のように申請者は、腎取込みトランスポーターOAT1, OAT3の機能をヒトin vivoで見積もり可能なプローブ基質薬物としてそれぞれadefovir, PCGが、またOAT1選択的阻害剤としてPAHが利用可能であることを、遺伝子発現細胞やヒト腎スライスを用いたin vitro実験により実証した。さらに、ヒト臨床研究の結果、adefovirは、OAT1選択的プローブとして用いうることが示唆される結果を得たが、PCGについては、OAT3の選択的基質でありながら、PAHとの併用試験の結果、腎クリアランスにおける再吸収の関与が認められたことから、PCGがOAT3の選択的なプローブ薬であるとは断定できないという結果を得た。

本研究は、個々のヒトトランスポーターの機能をin vivoで直接推定可能なプローブ薬物の探索を目指した研究であり、トランスポーター研究領域の最前線のトピックであることから非常に重要性の高い研究である。また、ヒト腎スライスを用いたin vitro実験を通じて妥当性を確認した後、その結果を踏まえてヒト臨床研究を実施して候補となるプローブ薬の長所・短所を明確にしており、研究デザインにもトランスレーショナルリサーチとしての一貫性が認められ、今後、他のトランスポーターを標的としたプローブ探索研究の雛形としても利用可能であり、極めて意義深い研究であるといえる。

よって、申請者を、博士(薬学)の学位を授与するに値するものと認めた。