Excessive applications of nitrogen fertilizer to maximize crop yields cause negative environmental effects such as pollution and ecological imbalance. To overcome this problem, researchers have attempted to improve the nitrogen assimilation capacity of crops. Maize Dof1 (ZmDof1) is a plant-specific transcription factor shown to promote nitrogen assimilation in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) even under nitrogen-deficient conditions. The present thesis shows successful generation of transgenic rice plants expressing ZmDof1 (Dof1 rice), and examines the effects of the introduction of the ZmDof1 gene on carbon and nitrogen assimilation in rice.

Chapter 1: Generation of transgenic rice plants expressing ZmDof1

Two binary vectors driving ZmDof1 either by cauliflower mosaic virus 35S promoter or maize ubiquitin promoter (ZmUbi-1) were constructed. Transformations into rice calli by Agrobacterium tumefaciens were taken place with both constructed binary vectors. However, only transgenic rice plants expressing ZmDof1 driven by ZmUbi-1 (Dof1 rice) was successfully generated.

Southern hybridization analysis of T1 generation of Dof1 rice with Dof1-specific probe revealed successful insertions of 1-5 copies of T-DNA. Segregation analysis performed on the T2 generation showed that single-copy homozygous Dof1 rice could not be obtained. The reason for this outcome is currently unknown, but this result was consistent with the previous study with Arabidopsis (Yanagisawa et al., 2004). Thus, it was decided to perform further analyses with T3 progenies of the Dof1 rice plants harboring ZmDof1 gene at multiple loci. Three independent lines were selected for further analyses based on seed formation and successful inheritance of ZmDof1 gene, and these lines were judged to have two copies of ZmDof1 gene on genome on the basis of the results of Southern hybridization analyses.

Chapter 2: Determination of experimental conditions for analyzing the effects of ZmDof1 expression in rice

There are three general developing phases in rice, vegetative, reproductive, and grain-filling phase. Since it is well known that nitrogen uptake and biomass production during the vegetative phage largely affects yield, it was decided to first evaluate ZmDof1 effects in rice at vegetative stage. The vegetative stage can be further divided into three sub-stages, seedling stage, early and late vegetative stages. In this study, seedling stage, early and late vegetative stages were considered as 2, 4, and 8 weeks after germination respectively. Effects of ZmDof1 expression were analyzed at each vegetative sub-stage to determine in which growth stage the effects of ZmDof1 in rice would be the most evidently observed. Measurements and comparisons of dry weight as well as nitrogen contents between Dof1 and VC rice plants revealed that the differences between Dof1 rice and VC rice plants became larger as the cultivation length became longer. Based on these results, it was decided to perform more detailed analyses to evaluate ZmDof1 effects in rice at 8 weeks after germination.

Chapter 3: Evaluations of primary characteristics of transgenic rice plants expressing ZmDof1

ZmDof1 induced the expression of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) genes in Dof1 rice plants and transactivated the rice PEPC promoters in protoplast transient assays, showing similar effects in rice as in Arabidopsis. Dof1 rice grown in the presence of 360μM (sufficient) or 90μM (deficient) of nitrogen concentrations showed modulation of metabolite contents and gene expressions associated with the anaplerotic pathway for the TCA cycle, suggesting an increased carbon flow toward nitrogen assimilation. One of the most significant alterations observed in Dof1 rice was the increase in asparagine concentrations especially in roots. Furthermore, increases in carbon and nitrogen amounts per seedling were found in Dof1 rice grown under nitrogen-deficient conditions. Nitrogen deficiency also resulted in the predominant distribution of nitrogen to roots, accompanied by significant increases in root biomass and modification of the shoot-to-root ratio. Measurements of the CO2 gas exchange rates showed a significant increase in the net photosynthesis rate in Dof1 rice under nitrogen-deficient conditions.

Chapter 4: Effects of ZmDof1 expression in rice onto ammonium assimilation upon recovery from nitrogen starvation

Experiments in chapter 3 showed that ZmDof1 expression in rice enhanced nitrogen assimilation especially under nitrogen deficient condition. However, transcriptional alterations of major genes involved in nitrogen assimilation could not be observed. Therefore it was hypothesized that ZmDof1 effects might be able to be observed when nitrogen assimilation occurs dynamically. Thus, effects of ZmDof1 expression in rice onto ammonium assimilation was monitored by a tracer experiment using stable isotope, 15N. Nitrogen-deficient, two-week old seedlings fed with 90μM of 15N-labeled ammonium chloride indicated that the rates of initial ammonium assimilation to glutamine were faster in Dof1 rice. As a result, concentrations of subsequent and derivative amino acids of glutamine such as glutamate, aspartate and asparagine, were also found to be significantly higher until 6 hours after nitrogen supply. Contrary to this, concentrations of most amino acids significantly decreased at 48 hours after nitrogen supply, suggesting enhanced protein biosynthesis. These results implied that nitrogen metabolism was not altered abnormally by ZmDof1 expression in rice, but rather the nitrogen metabolism itself was accelerated by ZmDof1 expression in rice, which might enable Dof1 rice for faster nitrogen uptake and/or assimilation.

窒素は植物の必要栄養素の一つであり生育に不可欠であるが、人為的な大量の窒素施肥は環境に悪影響を与え、持続的農業にとって大きな問題となっている。このため、作物の窒素同化・利用効率の向上が求められている。窒素代謝は炭素代謝とも密接に関係しており、その両代謝経路に含まれる酵素量が極めて多いため、単一もしくは少数の酵素の変化のみで代謝経路全体に有効な影響を与えることは簡単ではない。転写因子の多くは複数の遺伝子発現に影響を与えることが知られている。転写因子の一つであるトウモロコシ由来のDof1(ZmDof1)は窒素同化の向上に結びつくことがシロイヌナズナ等で示されている。このため、本研究ではZmDof1遺伝子を主要作物であるイネに導入し、イネにおけるZmDof1の効果を窒素応答の側面から解析することを目的とした。

第1章では、ZmDof1遺伝子を導入したイネ(Dof1イネ)の作出を行った。CaMV35Sプロモーター又はZmUbi-1プロモーターを用いる2種類の形質転換体の作出を試みたところ、ZmUbi-1プロモーター系でのみ再分化個体を得ることができた。T1世代では、1~5コピーのZmDof1遺伝子の挿入が確認されたが、ZmDof1遺伝子を1コピーのみ有するDof1ホモ形質転換イネは獲得できなかった。これに対しZmDof1遺伝子を2コピー有する形質転換イネでは、ZmDof1遺伝子の後代への遺伝、生育および種子生産が安定的であったため、その後の研究はこれらZmDof1遺伝子を2コピー有する形質転換イネの内、独立した3系統を用いて行った。

第2章では、得られたDof1イネの窒素応答を検討する条件を確立した。本研究の目的がZmDof1導入効果を窒素応答の側面から解析することであることから、これらの試験を標準窒素区(360μMのN相当)、及び低窒素区(90μMのN相当)にて水耕栽培で行うこととした。また、栄養生長期のうち、幼苗期、栄養生長期初期、栄養生長期後期をそれぞれ播種後2、4、8週間後とし、イネにおけるZmDof1の影響が最も明確になる時期を調査した結果、Dof1イネとVCイネの差は生育時期が長くなるにつれ大きくなったため、以後の詳細な解析は栄養生長期後期である播種後8週間後に行うことが最適であると判断した。

第3章では、第2章までに確立した実験条件でDof1イネの窒素応答に関する様々な機能解析を行った。シロイヌナズナにおいてZmDof1がAtPEPC遺伝子発現を上昇させていたことから、Dof1イネのPEPC発現解析を行ったところ、ZmDof1発現量に比例していくつかのOsPEPCについて葉内発現量の有意な上昇が確認された。またこれに応じてDof1イネ葉身のPEPC最大酵素活性も上昇していた。これまでにPEPCを介したTCAサイクルへのアナプレロティックな炭素骨格の供給が報告されていたため、TCAサイクルに関与する遺伝子の発現解析と有機酸濃度の測定を行ったところ、イソクエン酸脱水素酵素やNADP依存型リンゴ酸脱水素酵素の発現上昇が認められ、またイソクエン酸の減少など有機酸濃度にも変化が見られた。このようにDof1イネの有機酸供給の活性化が示唆されたことから、窒素含量及び濃度の測定を行ったところ、Dof1イネでは葉、葉鞘、根において有意な上昇が確認された。また、葉と根中アミノ酸濃度の測定を行ったところ、葉よりも根で大きく変化し、特にグルタミン及びアスパラギン濃度が有意に上昇した。しかし、窒素代謝関連遺伝子の発現には大きな違いは認められなかった。

低窒素区においても同様の実験を行ったところ、同様の結果が認められた。加えて低窒素区ではDof1イネの乾物重、特に根の乾物重が有意に増加した。その結果、乾物重の地上部対地下部比はDof1イネで有意に減少した。さらにDof1イネで特に弱光条件化における光合成速度の有意な上昇が認められた。

第4章では、窒素飢餓回復時にアンモニウム同化に及ぼすZmDof1の効果を検討した。前章でDof1イネにおける窒素同化能の上昇が示されたが、アスパラギン濃度以外のアミノ酸に大きな変化は認められなかった。そこで窒素飢餓状態にあるDof1イネに安定同位体で標識した塩化アンモニウムを与え、Dof1イネの窒素吸収及び代謝の経時変化を調べた。その結果、Dof1イネでは、初期のアンモニウム同化産物であるグルタミン濃度の上昇幅が大きく、窒素同化1時間後の根中グルタミン濃度は有意に高かった。またDof1イネでは、グルタミンから派生するグルタミン酸やアスパラギン酸、アスパラギンの濃度も順じて高くなった。窒素同化後概ね24時間までには、ほぼ全てのアミノ酸が一定の濃度に達したが、48時間になると、Dof1イネの葉内アミノ酸濃度が顕著に減少した。これはタンパク質合成の促進に起因すると考えられた。Dof1イネとVCイネ間では総じて代謝産物の変動パターンが似ていることから、ZmDof1のイネにおける窒素代謝への効果は、代謝経路の改変ではなく、窒素代謝の活性化であることが示唆された。

以上、本研究では、ZmDof1遺伝子を導入したイネ(Dof1イネ)を初めて作出し、ZmDof1遺伝子が高発現することでPEPCを介したTCAサイクルへのアナプレロティックな炭素骨格の供給上昇を通じた窒素同化の促進が示唆された。また、特に低窒素条件下で窒素吸収量および乾物重の増大などが認められた。一連の研究結果は、作物における窒素同化・利用効率の向上のために重要な情報を提供するものであり、学術上、応用上貢献することが少なくない。よって審査委員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。