Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is an economically important, major reproductive pathogen of cattle. Due to the action of the virus in cell culture, a non-cytopathic (ncp) and cytopathic (cp) biotypes can be distinguished. In vivo, the two virus biotypes interact to cause the highly fatal mucosal disease in animals that are persistently infected with ncp BVDV. In vitro, ncp BVDV has no immediate effect on infected cells, while cp BVDV induces vaculation and cell death. This cell death is mediated by induction of apoptosis. The mechanisms that induce cp BVDV-mediated apoptosis are yet to be clarified. ncp BVDV encodes an active block to type I interferon (IFN) induction with more than one mechanism to bring about this block. The ability of ncp BVDV to block IFN is critical to establish persistent infection. BVDV is regarded a surrogate model of its relative hepatitis C virus as they share similarities in virological and molecular properties.

BVDV NS4A is a 64-residue protein of about 7-kD similar in size, composition, and hydropathic properties to the NS4A protein of the hepaciviruses. It acts as an essential cofactor of the NS3 serine protease and has a role in viral replication as a part of the viral replicase complex along with the other nonstructural proteins. Although HCV NS4A has been shown to interact with some host cell signaling pathways, nothing is known about BVDV NS4A interactions with host cell factors. In this thesis the author attempted to study molecular interactions between host-cell and BVDV NS4A.

In order to identify possible interacting partners with NS4A, the author performed a yeast two-hybrid screening and identified two RNA helicase proteins to be interacting partners of NS4A, retinoic acid inducible gene I (RIG-I) and melanoma differentiation associated gene 5 (MDA5). RIG-I and MDA5 are important proteins as they serve as cytoplasmic receptors for viral RNA leading to induction of type I interferons (IFN-α/β). The binding between the two helicases and NS4A was confirmed in vitro and in vivo in the context of infection with both BVDV biotypes, cp and ncp. The author showed the significance of NS4A interaction with MDA5 and RIG-I. The NS4A binding domains on MDA5 and RIG-I were identified to be helicase domain and C-terminal domain (CTD). Helicase and CTD of MDA5 and RIG-I are responsible of dsRNA binding. Upon binding with dsRNA, MDA5 and RIG-I go through conformational change to release their N-terminal caspase activation and recruitment domains (CARDs) initiating a signaling cascade which leads to IFN induction. Many viruses have been reported to interact with MDA5 and/or RIG-I in order to suppress IFN production. Here, gene reporter assay showed that NS4A has inhibitory effect on MDA5- and RIG-I-mediated activation of IFN-β promoter through its N-terminal domain. This inhibition suggests a role for NS4A in viral strategies to evade IFN response.

"RNA editing" is a biological process in which dsRNA undergoes adenosine (A) to inosine (I) editing through enzymes called adenosine deaminase act on RNA (ADARs). It has been suggested that ADARs play a role in antiviral pathways against various viruses. The author identified ADAR to be binding partner of NS4A and this binding was observed in vitro and in vivo. According to data from yeast two-hybrid screening, the NS4A binding domain on ADAR seems to be dsRNA binding motif which binds dsRNA to catalyze its hyper-editing. There is possibility that NS4A interferes with ADAR ability to bind dsRNA in order to prevent the action of this protein then prevents elimination of the virus. The ADAR binding domain on NS4A was identified as N-terminal domain.

Collectively, the data in this thesis suggest an important role of NS4A, beside its role in viral replication as a member of the replicase complex, as a player in the game between the virus and the host-cell machinery. The nature of the cellular proteins identified as binding partners of NS4A suggests that NS4A may have affinity to proteins with dsRNA binding capacity which may raise a new feature of NS4A. Being the interacting domain, N-terminal domain of NS4A seems to be important in NS4A interactions with RNA healicases and ADAR. Being the first evidence for BVDV NS4A interaction with some cellular proteins, these results may give new insights into studying the mechanisms by which BVDV can evade host immune system and establish persistent infections in its host.

牛ウイルス性下痢ウイルス(BVDV)は、畜産経営上重要で、牛の繁殖にも関わる主要な病原体である。培養細胞におけるウイルスの性状から、非細胞病原性(ncp)と細胞病原性(cp)の2つ生物型が知られる。この2つの生物型は、in vivoにおいてncp型ウイルスが持続感染した動物における致死的な粘膜病発症に共同して働くことが知られている。これに対し、培養細胞ではcp型ウイルスは細胞死を誘導するが、ncp型ウイルスは直接的変化を示さない。この細胞死はアポトーシスによることが報告されているが、いまだその詳細は不明である。また、ncp型ウイルスは複数のタイプIインターフェロン誘導阻害活性を示すことが明らかとなっており、このインターフェロン誘導阻害活性の結果、ncp型ウイルスは持続感染を起こし、この理由もあってウイルス学的、遺伝学的な面からC型肝炎ウイルス(HCV)のモデルと考えられている。

BVDVのNS4Aは64アミノ酸よりなる分子量7 kDaの蛋白であり、HCV NS4Aとサイズ、アミノ酸組成、疎水性などが類似している。HCV NS4AはNS3セリン・プロテアーゼの必須コファクターで、他の非構造蛋白質とともにウイルス複製複合体の一部をなす。HCV NS4Aは様々な宿主細胞シグナル伝達経路と相互作用することが知られているが、BVDV NS4Aについては全く知られていない。このため、申請者はBVDV NS4Aと宿主細胞因子の相互作用を分子生物学的に解析した。

第1章および2章では、申請者はイースト・2ハイブリッド法を用いてBVDV NS4Aと相互作用する2種のRNAヘリケース蛋白(RIG-IとMDA5)を同定した。RIG-IとMDA5は、ウイルスRNAによるタイプIインターフェロン誘導における主要な細胞側レセプターである。BVDV NS4Aと2種のRNAヘリケース蛋白との結合は、ncpおよびcp型ウイルスの双方で確認され、NS4Aの結合領域はRIG-IおよびMDA5のヘリケース・C末端領域であった。この領域はdsRNAとの結合領域であることが知られている。多くのウイルスでMDA5および/またはRIG-Iとの結合から、インターフェロン産生抑制が起こることが知られており、BVDV NS4AのRIG-IおよびMDA5結合でも同様の現象が認められた。これは、NS4Aのインターフェロン制御能を示唆している。

第3章では、BVDV NS4Aの細胞側結合パートナーとしてADAR(adenosine deaminase act on RNA)を同定した。ADARはdsRNAのadenosineをinosineに変換することによるRNA editingに関与し、種々のウイルスで抗ウイルス活性を示すことが報告されている。BVDV NS4AとADARの結合をin vivoおよびin vitroで実証するとともに、NS4AにおけるADARとの結合部位がN末端領域であることを確認した。さらに、ADAR 側のNS4Aとの結合部位はdsRNA結合モチーフであることを明らかとした。このことは、NS4AはADARとdsRNAの結合を阻害することにより、抗ウイルス作用を無効化する役割を果たしていることを示唆している。

本博士論文で得られた成果から、BVDV NS4Aの役割が複製複合体における働きのみならず、ウイルスと宿主細胞因子との相互作用において重要な役割を担っていることが明らかとなった。さらに、NS4AのN末端領域はこれら作用において重要な機能を果たしている。NS4Aの宿主細胞における結合パートナーは、dsRNA結合蛋白であった。dsRNAはRNAウイルス感染細胞内で形成され、宿主の自然免疫の引き金であることを考えると、今回の結果はBVDV NS4Aの機能を理解するために、非常に示唆に富む結果である。

以上本論文は、BVDVの感染におけるウイルス非構造蛋白質NS4Aの機能を解析するため、NS4Aが結合する宿主側因子を初めて同定したもので、NS4Aが宿主細胞の抗ウイルス作用である自然免疫に影響を与えることを明らかとした。この結果はBVDVのみならず人の重要な病原体であるHCVの病原性解析にも有用な知見を与えるものであり、学術上獣医学のみならず、医学にも貢献することが少なくない。よって、審査委員一同は本論文が博士(獣医学)論文として価値あるものと認めた。