Introduction

In neurons, kinesin superfamily proteins (KIFs) are important molecular motors that directionally transport various cargoes to axon or dendrites. Among these KIFs, KIF17 transports N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor subunit 2B (NR2B)-containing vesicles together with the scaffolding protein Mint1 along microtubules in dendrites. Since NMDA receptors are pivotal in the regulation of synaptic function in neurons, regulation of NMDA receptor trafficking from cell body to synapses should be important to modulate synaptic function. A previous work demonstrated that Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (CaMKII) phosphorylates KIF17 C-terminal tail domain (CTD) on Ser1029 to trigger the release of NR2B-containing vesicle from KIF17(-/-)However, how the NMDA receptor transport is controlled in neurons in living mouse brain is still unclear. In this study, I generated various KIF17 transgenic mouse lines and analyzed these mice to investigate the functional significance of the regulation of NMDA receptor transport in learning and memory.

Methods and Results

1.Generation of transgenic mice

(1) I introduced two kinds of mutation (S1029A and S1029D) into Ser1029 of kif17 CTD to mimic various phosphorylation states by PCR mutagenesis. KIF17 with S1029A mimics unphosphorylated form of KIF17(-/-)It binds to cargoes but does not release it. KIF17 with S1029D mimics a phosphorylated form, which does not bind to cargoes. Using these mutated and wild-type (WT) kif17 cDNA, I constructed three transgenic vectors designed to express (GEP)-fused KIF17s under the control CaMKIIα promoter.

(2) I microinjected these constructs into mouse pronucleus and established three transgenic mouse lines: TgA ((GEP)kif17(-/-)with S1029A), TgD ((GEP)kif17(-/-)with S1029D), and TgS ((GEP)-wild-type KIF17).

(3) To investigate the function of these exogenous proteins, I crossed the transgenic mice with kif17(-/-) mice to generate three transgenic mouse lines with kif17(-/-) background: TgSkif17(-/-), TgA/kif17(-/-) and TgD/kif17(-/-) mice.

2.Characterization of Tg+kif17(-/-) mice

(1) Western blot analysis showed the (GEP)KIF17 fusion protein was expressed in the forebrain region.

(2) Tg+/kif17(-/-) mice grew normally and their brains showed no obvious morphological abnormality.

(3) Immunoprecipitation indicated that (GEP)KIF17 and (GEP)KIF17A1029 were precipitated with the NR2B and Mint1 but (GEP)KIF17(D1029) did not.

3.Analysis of Tg+/kif17(-/-) mice

(1) Behavior experiments and electrophysiological analysis revealed that kif17(-/-) mice exhibited severe impairments in spatial memory and synaptic plasticity such as long-term potentiation (LTP) because of the disruption of KIF17-mediated NR2B transport (Yin et al., unpublished observation). Spatial memory and LTP were intact in TgS/kif17(-/-) mice, suggesting that the expression of wild-type (GEP)KIF17 into kif17(-/-) mice rescued these impairments. However, TgA/kif17(-/-) and TgD/kif17(-/-) transgenic mice showed impairments in spatial memory and LTP. These results suggest that not only binding of NR2B to KIF17 but also release of NR2B fromkif17(-/-)is a critical step for NR2B transport in vivo.

(2) I further investigated the intracellular localization of NR2B in the transgenic mouse neurons by immunocytochemical analysis. Double-staining of hippocampal neurons with antibodies against NR2B and Golgi marker showed an increased accumulation of NR2B in Golgi apparatus in TgDkif17(-/-) neurons. This result suggests that (GEP)KIF17D1029 is not capable of translocating NR2B from cell body to dendrites.

(3) I examined localization of NR2B in dendrites by double-labeling with NR2B/Synaptophysin or NR2B/MAP2. The amount of synaptic NR2B was significantly decreased in kif17(-/-) neurons. TgS/kif17(-/-) mouse neurons showed normal level of synaptic NR2B. In both TgA/kif17(-/-) and TgD/kif17(-/-) neurons, synaptic NR2B levels were decreased to almost the same level of kif17(-/-) mouse neurons. Interestingly, there is a marked difference between TgAkif17(-/-) and TgD/kif17(-/-) mouse neurons. Level of NR2B in dendritic shafts (colocalized with MAP2) was decreased in TgD/kif17(-/-) mouse neurons, but not in TgAkif17(-/-). Level of NR2A in dendrites was also decreased in kif17(-/-), TgA/kif17(-/-), and TgD/kif17(-/-) mouse neurons.

(6) I used surface biotinylation assay to detect the surface level of NR2B in primary hippocampal neurons. The level of surface NR2B was significantly decreased in kif17(-/-) neurons. TgS/kif17(-/-) mouse neurons showed normal level of surface NR2B. In both TgAkif17(-/-) and TgD/kif17(-/-) neurons, level of surface NR2B was decreased to almost the same level of kif17(-/-) mouse neurons.

(9) Water maze training induces up-regulation of phosphorylated CREB and nr2a/2b mRNAs in hippocampal neurons, as revealed previously (Yin et al. unpublished observation). Kif17(-/-) , TgA/kif17(-/-), and TgD/kif17(-/-) mice lacked this up-regulation. TgS/kif17(-/-) mice exhibited normal level of the up-regulation.

Summary

I generated three transgenic mouse lines; TgS/kif17(-/-), TgA/kif17(-/-) and TgD/kif17(-/-) mice. Using them, I examined a role of motor (KIF17)-cargo (Mint1/CASK/VELI/NR2B) interaction in synaptic accumulation of NR2B, neuronal plasticity (LTP), and spatial learning. Expression of (GEP)-KIF17 in forebrain regions rescued defects of kif17(-/-) mice in synaptic accumulation of NR2B (TgS/kif17(-/-)). In TgA/kif17(-/-) mouse neurons, (GEP)-mutated KIF17(-/-)which mimics unphosphorylated form, binds to the cargo but does not release it. As a result, NR2B entered into dendritic shafts but did not localize to synapses. In TgD/kif17(-/-) mouse neurons, (GEP)-mutated KIF17(-/-)which mimics phosphorylated form, does not bind to the cargo. As a result, NR2B was retained in Golgi-regions in cell bodies. TgA/kif17(-/-) and TgD/kif17(-/-) mice exhibited defects in CREB activation, LTP, and spatial memory formation, similar to those seen in kif17(-/-) mice.

These results suggest that phosphorylation-based regulation of motor (KIF17)-cargo (Mint1/CASK/VELI/NR2B) interaction plays critical roles in the process of spatial learning and memory.

本研究はキネシンスーパーファミリー(kinesin superfamily proteins、KIFs)のメンバーの1つであるモーター分子KIF17の生体内での役割及び細胞内での分子機能を明らかにするため、3種のkif17変異トランスジェニック・マウス系統を作成し、各々表現型を解析したものであり、下記の結果を得ている。

1. KIF17はMint1との結合を介してNMDA受容体のサブタイプ2B (NR2B)を輸送する (Setou et al. Science 2000)。これまでのIn vitroの実験結果により、KIF17とMint1の結合はKIF17C末ドメイン(Cargo-binding domain)のリン酸化によって制御されていることが想定されていた (Guillaud et al. Nat Cell Biol. 2008)。そこで私はKIF17遺伝子のC末ドメインに変異を導入し、リン酸化された状態に相当するKIF17(S1029D)、リン酸化されていない状態に相当するKIF17(S1029A)のそれぞれにGFPを融合させた2種の変異遺伝子ベクターを作成した。これらの変異遺伝子を前脳特異的に発現するトランスジェニック・マウス(TgAとTgD)および正常KIF17にGFPを付加した遺伝子を発現するトランスジェニック・マウスを作成した(TgS)。これらのトランスジェニック・マウス系統をkif17遺伝子欠損マウスと交配し、endogenousのKIF17をノックアウトした遺伝子背景を持つトランスジェニック・マウス系統とした(TgS/kif17(-/-)、TgA/kif17(-/-), TgD/kif17(-/-))。

2.GFP-KIF17(S1029D)がMint-1/NR2B複合体に結合しないこと、GFP-KIF17(S1029A)およびGFP-野生型KIF17がMint-1/NR2B複合体に結合することを免疫沈降実験で確認した。

3.KIF17ノックアウトマウスはNR2Bのシナプスへの集積の低下、シナプス可塑性 (海馬CA1領域の長期増強)の減弱、および空間記憶の障害を示す (Yin et al., Neuron, in press)。TgSkif17(-/-)マウスでは、NR2Bシナプス集積、長期増強、空間記憶いずれも野生型マウスと同程度のレベルに回復しており、GFP-野生型KIF17の発現による遺伝子レスキューが示された。

4.KIF17ノックアウトマウスおよびTgD/kif17(-/-)マウス海馬ニューロンでは、NR2Bのレベルは樹状突起でもシナプス領域でも低下しており、ゴルジ領域で逆に増加していた。これは、Golgi体から樹状突起への輸送が低下していることを示唆する。一方、TgA/kif17(-/-)マウス海馬ニューロンでは、NR2Bは樹状突起シャフトに局在するが、シナプス領域のNR2Bは低下していた。すなわち、NR2Bは樹状突起シャフトまで輸送されているが、シナプスへの移行が阻害されていることがわかった、

5.KIF17ノックアウトマウスおよびTgA/kif17(-/-)とTgD/kif17(-/-)トランスジェニック・マウスはいずれも海馬CA1長期増強低下と空間記憶獲得障害を示した。

6.NMDA受容体活性化によって惹起されるCREBリン酸化がKIF17ノックアウトマウス、TgA/kif17(-/-)とTgD/kif17(-/-)トランスジェニック・マウスで低下していた。

7.KIF17ノックアウトマウス、TgA/kif17(-/-)とTgD/kif17(-/-)トランスジェニック・マウスでシナプスのNR2Aのレベル低下が観察された。

8.以上より、KIF17ノックアウトマウス、TgA/kif17(-/-)とTgD/kif17(-/-)トランスジェニック・マウスでは、NR2BおよびNR2Aのシナプスでのレベル低下の結果、CREB依存的神経可塑性の減弱と、学習・記憶障害をきたしていると考えられる。KIF17ノックアウトマウスにおけるNR2Aの低下の原因は、NR2A蛋白分解の亢進によることが既にあきらかにされている(Yin et al., Neuron, in press)が、TgA/kif17(-/-)とTgD/kif17(-/-)トランスジェニック・マウスについては今後の検討課題である。

9.本論文は新しく作成した3系統のトランスジェニック・マウスのシステマティックな解析により、in vivoの神経回路網に於いてモーター分子(KIF17)とCargo (Mint1/CASK/VELI/NR2B)の相互作用のリン酸化ベースの制御が学習・記憶に重要な役割を果たしていることをはじめて明らかにした。本研究は学習・記憶の基礎的メカニズムの理解に重要な貢献をなすものであり、学位の授与に値すると考えられる。