A型インフルエンザウイルスは毎年冬季に流行し、感冒様症状を引き起こすRNAウイルスである。インフルエンザウイルスのゲノムは8本に分節化されているため、異なる二種類のウイルスが共感染することによる遺伝子交雑が起きやすい。このような遺伝子交雑は抗原性の大幅な変化を引き起こし、パンデミック(世界的大流行)につながることがある。前世紀には、スペイン風邪(1918年)、アジア風邪(1957年)、香港風邪(1968年)という三度のインフルエンザウイルスによるパンデミックが起こり、多数の死者が出た。今世紀では、既に2009年に新型H1N1亜型ウイルスによるパンデミックが引き起こされている。

現在のインフルエンザウイルスに対する防御策は、ワクチンと抗ウイルス薬に大別される。しかしながら、ヒトインフルエンザウイルスは抗原性の変化が早いため、ワクチン株を数年に一度更新する必要がある。また現行の抗ウイルス薬に対して耐性ウイルスが出現している。従って、インフルエンザウイルスの感染制御のために、インフルエンザウイルスの感染細胞内における増殖機構を解明し、新たな抗ウイルス薬のターゲットを同定することが求められている。

本研究では、新たな抗ウイルス薬のターゲットとして、インフルエンザウイルスのRNAに着目し、感染細胞内におけるインフルエンザウイルスRNAの動態の解析を行った。

第一章インフルエンザウイルスvRNA, cRNA, mRNAを区別するためのstrand特異的real-time RT-PCR法の確立

インフルエンザウイルスのゲノムであるvRNAは感染細胞内の核内において、ウイルスのポリメラーゼにより転写・複製を受ける。具体的には、転写反応により、5' cap構造およびpoly A tailを持つmRNAが合成され、複製反応によりvRNAに完全に相補的なcRNAが作られる。さらに、cRNAをテンプレートとして新しいvRNAが大量に合成される。

これらの転写・複製反応は全て同一のウイルスポリメラーゼ複合体によって行われるにも関わらず、感染初期には転写反応が、感染後期には複製反応が主に起こることが知られている。転写・複製の切り替えを行う因子の存在が示唆されており、いくつかのモデルが提唱されているものの、統合的な説明には至っていない。

インフルエンザウイルスの転写・複製制御機構を理解する上で、vRNA, cRNA, mRNAを区別して定量する方法が必要不可欠である。近年、その方法の一つとして感度が高く、簡便なreal-time RT-PCRが用いられるようになった。従来のreal-time RT-PCRにおいては、vRNA, cRNA, mRNAを配列特異的なプライマーを用いて逆転写し、共通のプライマーセットでreal-time PCRを行うことにより定量していたが、特異性に関して十分な検証がなされていなかった。

本研究では、逆転写反応の配列特異性が非常に低く、プライマー非依存的に反応が起こることを見出した。このことが原因で、従来のreal-time RT-PCR法によるvRNA, cRNA, mRNAの区別は極めて不十分であることが明らかにした。この問題を解決するために、人工的なtag配列を付加したプライマーを逆転写反応に用い、さらにtag配列と内部配列によりreal-time PCRを行った。また、逆転写反応において、酵素を安定化するトレハロースを用いることで、従来よりも高温での反応を可能にし、配列特異性を向上させることに成功した。これら二つの改良を適用することにより、vRNA, cRNA, mRNAを極めて特異的に検出できるreal-time PCR法を確立した。In vitro合成したRNAをスタンダードに用いることにより、新しいstrand特異的real-time PCR法は高い感度と定量性を持つことを示された。

さらに、新しく確立したstrand特異的 real-time PCR法により、細胞内vRNA, cRNA, mRNA量の経時的な変化の定量を行った。vRNAが感染初期から後期にわたって増え続けるのに対し、cRNA量は感染後6時間程度で一定となった。一方、mRNAは感染後5時間までは指数関数的に増えたが、感染後5時間以降は急激に減少した。また、NP分節とNA分節のvRNAと cRNA 量はあまり差がないのに対し、mRNA量はNP分節の方がNA分節よりも10倍程度多いことが明らかになった。

本研究で確立された、strand特異的real-time PCR法は、細胞内の分節ごとのvRNA, cRNA, mRNA量を区別して、正確に定量できるという点において、インフルエンザウイルスRNAの細胞内動態を解析するのに非常に有用である。今回着目したインフルエンザウイルスの転写・複製機構だけではなく、vRNA細胞内輸送機構、vRNAのウイルス粒子への取り込み機構および関連する宿主因子の機能を解明するうえでも強力なツールとなることが期待される。

第二章Fluorescence in situ hybridization (FISH)法によるインフルエンザウイルスRNA細胞内動態の可視化

インフルエンザウイルスのゲノム(vRNA)は8本に分節化されており、それぞれ一つもしくは二つのタンパク質をコードしている。感染細胞の核内において、vRNAはウイルスのポリメラーゼ複合体により転写・複製を受ける。複製により増幅されたvRNAはウイルスのポリメラーゼおよび核タンパク質(NP)と結合し、複合体(vRNP)を形成する。vRNPは宿主の核外輸送機構を利用して細胞質に出たのち、粒子形成の場である形質膜直下まで輸送される。

従来、RNAを直接検出する手段が確立されていなかったため、vRNAの細胞内における局在はNPに対する免疫染色により観察されてきた。しかしながら、NPのRNA結合は配列特異性がないこと、RNAに結合していないNPが存在しうることから、NPの免疫染色はvRNAの細胞内局在を正確に表しているとは言えない。また、8本の分節それぞれの局在に違いがあるのかどうかも明らかになっていなかった。

本研究では、インフルエンザウイルスのRNAを直接的に検出するためにfluorescence in situ hybridization (FISH)法を確立し、インフルエンザウイルスRNA細胞内動態の可視化を行った。

FISH法による経時的観察から、vRNAは感染初期において核内にのみ観察され、感染後5時間くらいで細胞質に移行することが明らかになった。感染後期の細胞質において、vRNAは核近傍に集積し、この集積はウイルスタンパク質の一つであるNS2、また微小管の集積と一致した。一方、別のウイルスタンパク質M1はこのような集積を示さなかった。このことにより、vRNPが微小管依存的な、M1とは異なる経路により形質膜直下に輸送されることが示唆された。

また、NPの免疫染色の結果の対比から、細胞質においてvRNAはNPと非常によく似た局在を示すのに対して、ウイルスのmRNAは全くNPと共局在しないことが明らかになった。この結果から、vRNAが細胞質においてはほぼvRNP複合体の形で存在していること、ウイルスのmRNAにNPは結合していないことがわかった。

さらに、各vRNA分節特異的なプローブを用いてFISHを経時的に行うことにより、分節間に経時的な細胞内局在の違いが存在することを明らかにした。すなわち、感染中期(感染後5時間程度)において、いくつかの分節は細胞質に大部分が移行しているのに対し、いくつかの分節は多くが核に留まったままであった。これらの局在の違いは分節がコードするタンパク質の発現時期と非常によく相関しており、vRNAの局在によるウイルスタンパク質の発現制御機構の存在が示唆された。

本研究において、各分節のvRNAおよびmRNAの局在を可視化することにより、ウイルスタンパク質の発現制御に関する重要な知見が得られた。これらの知見はインフルエンザウイルスの感染細胞内における増殖機構を明らかにする上で極めて有用であると考えられる。

本研究は、インフルエンザウイルス感染細胞内におけるインフルエンザウイルスゲノムRNA分節間の動態の違いを明らかにするためにreal-time RT-PCRおよびFluorescence in situ hybridization (FISH)法を用いて解析を行ったもので、以下の知見を得ている。

1.インフルエンザウイルスのRNAはvRNA, cRNA, mRNAという3つの形態を有するが、従来のreal-time RT-PCR法ではこれら3つを区別することができていないことが、in vitro合成したRNAをスタンダードとして用いた実験により明らかになった。これは、real-time RT-PCRの逆転写反応の非特異性に由来するものであった。tag付きプライマーを用いた配列特異的逆転写反応および、trehaloseを用いたhot start法を組み合わせることにより、逆転写反応の特異性を向上させることに成功し、vRNA, cRNA mRNAの特異的な定量を可能にした。

2.上記のstrand特異的real-time RT-PCR法を用いてインフルエンザウイルス感染細胞内のvRNA, cRNA, mRNA量の変化を定量したところ、vRNAは感染後12時間後まで増え続けたのに対し、cRNAは感染後6時間程度で一定となった。一方、mRNAは感染後6時間までは指数関数的に増えたが、感染後6時間以降は急激に減少した。また、NP分節とNA分節のvRNA量とcRNA量はあまり差がないのに対し、mRNAはNP分節の方がNA分節よりも10倍程度多いことが明らかになった。

3.FISH法による経時的観察から、vRNAは感染初期において核内にのみ観察され、感染後5時間程度で細胞質に移行することが明らかになった。感染後期の細胞質において、vRNAは核近傍のmicrotubule organizing center (MTOC)と呼ばれる場所に集積し、この集積はNS2の集積と一致した。一方、別のウイルスタンパク質M1はこのような集積を示さなかった。また、vRNAの集積は微小管重合阻害剤であるnocodazolで細胞を処理することにより、微小管とともに細胞質全体に分散した。このことから、vRNPが微小管依存的な、M1とは異なる経路により出芽の場である形質膜直下に輸送されている可能性が示唆された。

4.FISH法とインフルエンザNPタンパク質の免疫染色の対比から、細胞質においてvRNAはNPと非常によく似た局在を示すのに対し、ウイルスのmRNAは全くNPと共局在しないことが明らかになった。

5.各vRNA分節特異的なプローブを用いてFISH法を経時的に行うことにより、分節間に経時的な細胞内局在の違いが存在することを明らかにした。すなわち、感染中期(感染後5時間程度)において、いくつかの分節は細胞質に大部分が移行しているのに対し、いくつかの分節は多くが核に留まったままであった。これらの局在の違いは分節がコードするタンパク質の発現時期と非常によく相関しており、vRNAの局在によるウイルスタンパク質の発現制御機構の存在が示唆された。

以上、本論文はインフルエンザウイルスRNAの新規解析手法を確立したことに加えて、インフルエンザウイルスの細胞内動態においてゲノムRNA分節ごとの量、局在の違いを明らかにした。本研究は、インフルエンザウイルスの転写・複製制御機構およびゲノムRNAの細胞内輸送機構の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。