Warfarin is a commonly-used anticoagulant whose dose needs to be determined for each individual patient owing to large inter-individual variability in its therapeutic dose. Several clinical and genetic factors have been shown to influence warfarin dose, and these predictors include age, body size, co-administration of drugs and intake of vitamin K. Recently, several studies have disclosed that genetic variations in the CYP2C9 and the VKORC1 genes are associated with the effect of warfarin. Nevertheless, a large part of inter-individual variability in warfarin maintenance dose remains unexplained. Hence, uncovering additional predictors of the dose is critically important for the safer use of this drug. To identify genetic determinants of warfarin responsiveness in Japanese, I performed both a candidate gene study and a genome-wide association study (GWAS).

In the candidate gene study, I determined genetic variations in eight genes that were known to play important roles in the mode of action of warfarin, and examined their associations with warfarin responsiveness. The eight genes include GGCX, GAS6, PROC, PROS1, PROZ, PXR, CAR, and HNF4A, encoding the gamma-glutamyl carboxylase, protein C, protein S, protein Z, growth-arrest specific 6, pregnane X receptor, constitutive androstane receptor, and hepatocyte nuclear factor 4 alpha, respectively. Among the eight genes, GGCX, a vitamin K-dependent (VKD) carboxylase, is involved in the activation of VKD proteins. By means of direct sequencing, an 18-kb genomic region containing the GGCX gene was analyzed in 96 Japanese subjects who received warfarin therapy. A total of 41 single nucleotide polymorphisms (SNPs), seven insertion/deletion polymorphisms, and a microsatellite polymorphism were identified. I compared the genotypes of these polymorphisms with the warfarin maintenance dose, but no significant associations were observed in the 96 subjects. In addition, I investigated a total of 80 functional SNPs and tagging SNPs (tSNPs) in the remaining seven candidate genes, namely, PROC, PROS1, PROZ, GAS6, PXR, CAR, and HNF4A in the 96 subjects. All tSNPs analyzed in this study were reported to have minor allele frequencies of greater than 10% in the Japanese HapMap database and covered most of haplotypes in linkage disequilibrium blocks encompassing the seven genes (R2>0.8). In total, 14, 7, 9, 10, 5, 9, and 26 SNPs for each of the aforementioned genes were genotyped, respectively. Subsequent association studies revealed that none of the SNPs showed significant associations with warfarin responsiveness.

In the GWAS, I carried out genotyping of 1515 Japanese subjects including 811 whose therapeutic warfarin dose are ≦1mg/day and 704 whose therapeutic warfarin dose are ≧4mg/day. Comparison of the genotypes between the two groups identified 18 SNPs that showed suggestive associations (P < 1x10-5) with warfarin responsiveness. A subsequent replication study using an additional 444 Japanese subjects revealed that an SNP, rs2108622, in the CYP4F2 was significantly associated with warfarin responsiveness (PCombined=2.57 x 10-8). The effect of SNP rs2108622 (CYP4F2) in the association could be masked by the stronger effects of age, body surface area (BSA), and SNPs in the CYP2C9 and VKORC1 genes that were reported to influence the warfarin dose of Japanese. In addition, detailed analysis of the data enabled me to estimate that a T-allele of rs2108622 would increase the warfarin maintenance dose by 0.23mg/day. Furthermore, I found through a regression analysis that co-administration of amiodarone, an inhibitor of CYP2C9, also significantly influence therapeutic warfarin dose. On the basis of these findings, I developed a warfarin dosing algorithm that incorporated not only information on age, BSA, and genotypes of SNPs rs10509680 (CYP2C9) and rs9923231 (VKORC1), but also the status of amiodarone co-administration and genotypes of SNP rs2108622 (CYP4F2). This algorithm correctly predicted 43.4% of warfarin dose variability of the 444 subjects. Although the dosing algorithm is preliminary and subsequent evaluation of it in prospective study is necessary, the findings shown in this study have deepen our understanding on the pharmacogenetics of warfarin and paved a way to the safer use of the drug.

ワーファリンは経口抗凝固薬であり、肝臓でのビタミンKの代謝サイクルを阻害することにより薬効を発揮する。しかしながら、ワーファリンに対する反応性に個人差があるため、患者毎に適切なワーファリン維持用量を事前に予測することが困難である。これまでに報告されているワーファリン感受性関連遺伝子はCYP2C9とVKORC1のみである。そこで本研究は、新たなワーファリン感受性関連遺伝子の同定を目的としている。研究手法としては、候補遺伝子アプローチとゲノムワイドアプローチの2つを用いた。

1. 候補遺伝子アプローチにおいて、ビタミンKの代謝サイクルに重要な役割をもつ遺伝子を8つ選んで、96人の日本人ワルファリン投与患者のDNAを用いて、それぞれの遺伝子上の遺伝子多型のジェノタイプを調べ、関連解析を行った。

1)まず、GGCX遺伝子を含む18kbのゲノム領域のシークエンス解析を行った。その結果、41 SNPs, 7つのinsertion/deletion 多型及び1つのマイクロサテライト多型 (数塩基の反復配列)が同定した。それぞれの遺伝子多型のジェノタイプが、個々の患者のワーファリン維持用量に関連するかどうかを検討したが、有意な関連は認められなかった。

2)次に、7つのワーファリン感受性関連候補遺伝子(GAS6, PROC, PROS1, PROZ, PXR, CAR及び HNF4A)内の計80のタグSNPまたは機能的なSNPについてジェノタイプを解析した。SNPのジェノタイプと患者のワーファリン維持用量の関連解析を行ったが、有意な関連は認められなかった。

2. ゲノムワイドアプローチにおいて、ワーファリン維持用量が1mg/day以下の患者811人と維持用量が4mg/day以上の患者704人のDNAを用いて、ゲノムワイド関連解析を行った。

1)それぞれのSNPのジェノタイプと患者のワーファリン維持用量の関連を回帰分析で検討し、関連がある(Suggestive association)18のSNP (P<1x10-5)を同定した。これらのワーファリン感受性関連候補SNPについて、444人の独立した別の日本人集団で再現性を検証した。その結果、CYP4F2のSNPであるrs2108622がワーファリン維持用量に有意な関連(PCombined=2.57 x 10-8)を示すことが分かった。これは日本人において初めての報告である。

2)また、回帰分析により、患者の年齢、体表面積、そしてCYP2C9 (SNP rs10509680)及びVKORC1 (SNP rs9923231)の多型がワーファリン維持用量に強く関連しているため、CYP4F2 (SNP rs2108622)とワーファリン維持用量の関連が隠されることが明らかになった。

3)SNP rs2108622(V433M 多型)の変異型ホモ接合体である TT 型(M433/M433)とヘテロ接合体である TC 型(V433/M433)を持つ患者は、野生型ホモ接合体であるCC型 (V433/V433) よりワーファリン維持用量が高いことが明らかになった。さらに、Tアレルがワーファリン維持用量を0.23mg/day増加させることが推定された。それに対し、CYP2C9 (SNP rs10509680)のGアレル及びVKORC1 (SNP rs9923231)のCアレルを持つ患者は、それぞれCYP2C9 (SNP rs10509680)のTアレル及びVKORC1 (SNP rs9923231)のTアレルを持つ患者よりも0.70mg/day、1.39mg/dayワーファリン維持用量が多いことが示された。また、回帰分析により、CYP2C9の阻害剤であるアミオダロンを併用した場合、ワーファリン維持用量が低下することも明らかになった。

4)以上の結果に基づいて、ワーファリン維持用量を予測するアルゴリズムの構築を試みた。上記の6つの環境要因及び遺伝要因(年齢、体表面積、アミオダロンの併用、CYP2C9 (SNP rs10509680)、VKORC1 (SNP rs9923231)及びCYP4F2 (SNP rs2108622)のジェノタイプ)を含む予測式Predicted daily warfarin dose=1.823954-(0.023583*Age in year) + (1.118196*BSA incm2) + (0.697966*CYP2C9's genotype) + (1.386091*VKORC1's genotype) + (0.22656*CYP4F2's genotype)-(0.755881*Status of amiodarone administration)を作成できた。またこのアルゴリズムを用いてにより、解析した444例のうち43.4%のワーファリン維持用量の個人間変動が説明可能であった。

5)本研究で同定されたCYP4F2は薬物代謝酵素の一つである。今までの報告において、SNP rs2108622(V433M 多型)の野生型ホモ接合体であるCC型(V433/V433)に比べて、変異型ホモ接合体である TT 型(M433/M433)のリコンビナントCYP4F2によるビタミン K1 酸化酵素活性は低下していることが示されている。すなわち、SNP rs2108622(V433M)のTアレルをもつ患者では,酵素活性の低下によってビタミン K1 代謝が抑制されるために肝臓内ビタミンK1 濃度が上昇するので,VKORC1(ビタミン K 還元酵素)の阻害剤であるワルファリンの維持用量が増加することが考えられた。

以上、本論文はCYP4F2 遺伝子が日本人においてもワーファリン感受性関連遺伝子の一つであることを明らかにした。本研究はこれまで報告されていなかった、CYP2C9とVKORC1以外のワーファリン感受性関連遺伝子の解明に重要な貢献を果たしたと考えられ、また、将来的に、患者の体質に応じた適切なワーファリン維持用量を予測することができるアルゴリズムを構築しており、学位の授与に値するものであると認める。