Oncolytic virus therapy is an emerging treatment strategy for cancer. The third generation oncolytic Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) named G47Δ was designed to selectively replicate in tumor cells by introducing three genomic alterations: deletions in both copies of the γ34.5 gene, inactivating lacZ insertion in the infected-cell protein 6 gene, and a deletion in the α47 gene along with the overlapping US11 promoter region. Previous studies have demonstrated that G47Δ exhibits an efficient oncolytic activity in various tumor cells, yet minimal toxicity in normal tissues.

In the course of drug development, it is necessary to study the kinetics such as absorption, distribution, and excretion of the therapeutics from a biological system. Conventionally, virus biodistribution studies were performed by obtaining tissue biopsies at certain time points from virus treated animals. However, with this method, one animal provides information for one time point, therefore only limited information can be obtained due to the unavailability of longitudinal studies, and the possibility of missing unpredicted replication sites or time points. To overcome these limitations, molecular imaging technologies have been developed to visualize viral infection and replication in living animals. In this study, we aim to elucidate the biodistribution and kinetics of G47Δ through in vivo imaging of a newly developed luciferase-expressing recombinant HSV-1. We constructed two new viruses, T-lucCMV and T-lucUS11, by inserting the CMV-promoter-driven luciferase gene and the Us11-promoter-driven luciferase gene, respectively, into the backbone of G47Δ. Theoretically, cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter allows a short expression of the luciferase gene immediately upon infection of the virus regardless of its replication capability, whereas the Us11 promoter, a strict late promoter, drives the luciferase gene only when the virus is replicating: The luciferase expression by T-luc(CMV) should indicate fresh virus infection, and that by T-luc(US11) should indicate ongoing virus replication.

After confirming the genome structures of the T-luc(CMV) and T-luc(US11) by Southern blot analyses, we studied the basic characters of T-luc(CMV) and T-luc(US11) in comparison to a control virus T-01. In vitro viral replication capabilities and cytopathic efficacies of T-luc(CMV) and T-luc(US11) showed comparable results compared to those of T-01. The in vivo antitumor efficacies of T-luc(CMV) and T-luc(US11) were also similar to that of T-01 when tested in A/J mice bearing subcutaneous Neuro2a tumors. Therefore, we concluded that the expression of the luciferase gene does not interfere with viral infection, replication and its cytopathic efficacy.

The in vitro luciferase assay showed that, while T-Luc(CMV) expressed luciferase immediately after infection as predicted, the luciferase expression pattern of T-Luc(US11) did not seem to reflect the course of virus replication precisely. However, since luciferase expression under the CMV promoter rapidly declines after viral DNA synthesis takes place, a persistent luminescence reflects continuously occurring fresh infections by progeny viruses resulting from virus replication. Therefore, with T-Luc(CMV), we were able to monitor both viral infection and replication. When T-Luc(CMV) was injected intratumorally into subcutaneous tumors, the local luciferase expression was detected up to day 7 in Neuro2a tumors in A/J mice, and for more than 14 days in U87MG tumors in athymic mice. The T-Luc(CMV) infection was not detected from any other organs at any time point after an intratumoral administration. An intravenous administration of T-Luc(CMV) in both A/J and athymic mice resulted in a high expression of luciferase in the liver, but rapidly vanished within 48 hours. Contrastingly, when athymic mice bearing subcutaneous U87MG tumors were injected intravenously with T-Luc(CMV), the luciferase expression in tumors became detectable after one day, and grew stronger and persisted for more than two weeks. When T-Luc(CMV) was injected into intracerebral tumors, the luciferase expression was detectable up to day 6 for Neuro2a tumors, and for more than two weeks for U87MG tumors.

We conclude that in vivo imaging of the luciferase-expressing recombinant HSV-1 is a reliable and efficient method to investigate viral biodistribution and kinetics in living animals, and has vast applications in future studies of oncolytic virus therapy.

本研究は癌治療用第三世代遺伝子組換え単純ヘルペスウイルス1型(G47Δ)の生体における分布及び動態を明らかにするため、ルシフェラーゼ発現型の第三世代遺伝子組換え単純ヘルペスウイルス(T-luc(CMV))を用いた生体分子イメージングシステムを開発し、正常或は担癌マウスに種々の経路でT-luc(CMV)を投与した後にIVIS (in vivo imaging system)にてウイルスの分布と経時的変化を追跡し、下記の結果を得ている。

1.異なるプロモータに制御されるルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだ二種類のウイルス(T-luc(CMV)及びT-luc(US11))の配列、性質を確認した結果、それらの増殖能、殺細胞効果と抗腫瘍作用は、in vitro、in vivo共にG47Δと有意差がなく、ルシフェラーゼ発現がウイルス複製に影響しないことが示された。

2.in vitroルシフェラーゼアッセイにてT-luc(CMV)とT-luc(US11)のシフェラーゼ発現を確かめたところ、immediate early CMVプロモータに制御されるルシフェラーゼを組み込んだT-luc(CMV)は細胞に感染した直後から大量にルシフェラーゼを発現し、ウイルスの感染を反映することが分かった。一方、T-luc(US11)の場合、ルシフェラーゼ遺伝子がUS11というstrict lateプロモータに制御されているにもかかわらず、感染直後にも少量発現していることが確認され、ウイルスの複製のタイミングを正確に反映できないことが分かった。

3.Neuro2aもしくはU87MGの皮下腫瘍モデルにT-luc(CMV)を腫瘍内投与したところ、腫瘍に限局して長期のルシフェラーゼ発現が見られ、A/Jマウスでは投与後7日間、ヌードマウスでは14日間以上検出された。また、腫瘍以外の組織でのルシフェラーゼ発現はいずれのマウスモデルにおいても認められなかった。

4.正常なA/JマウスもしくはヌードマウスにT-luc(CMV)を尾静脈内投与し、ウイルスの体内分布を調べた結果、投与直後に肝臓に高いルシフェラーゼ発現を観察するものの2日間で消失した。尾静脈にてT-luc(CMV)を投与されたマウスの肝臓を摘出し、感染性ウイルスを調べた結果、投与翌日以降の肝臓組織からは感染性ウイルスが検出されなかった。同サンプルを用いてリアルタイムPCRを行ったところ、検出されるHSV-1のDNA量は投与当日より著しく減少することが示され、T-luc(CMV)が肝臓では複製しないことが分かった。

5.U87MG皮下腫瘍を有するヌードマウスへの尾静脈内投与では、皮下腫瘍におけるルシフェラーゼ発現が15日以上検出され、T-luc(CMV)は尾静脈内投与でも、皮下腫瘍に到達し、特異的に複製することが分かった。

6.正常なA/JマウスもしくはヌードマウスにT-luc(CMV)を脳内投与したところ、ルシフェラーゼ発現量は投与二日後から著しく減少するが、持続的なルシフェラーゼ発現が観察された。しかし、脳組織から感染性ウイルスは検出されなかったことから、正常脳組織におけるルシフェラーゼ発現はウイルス複製によるものではないと考えられた。

7.U87MG脳腫瘍を有するヌードマウスへの腫瘍内投与では、脳腫瘍を移植した部位に持続的な発光が見られ、投与一週間後の時点に、発光の増強が観察され、T-luc(CMV)が脳腫瘍内で複製していることが分かった。

8.Neuro2a皮下腫瘍を持つA/Jマウスにインターロイキン18(IL-18)とT-luc(CMV)の併用療法を行ったところ、IL-18によるT-luc(CMV)のルシフェラーゼ発現量及び発現のタイムコースへの影響が認められなかったため、IL-18による抗腫瘍効果の増強はウイルスの複製が促進されたからではないということが確認できた。

以上、本論文はルシフェラーゼ発現型遺伝子組み換えHSV-1のルシフェラーゼ発現を生体分子イメージングシステムにて継時的に観察することから、実験動物における第三世代のがん治療用HSV-1の分布と動態を明らかにした。本研究は第三世代がん治療用HSV-1の臨床応用に有用な情報を提供し、また本研究で開発されたイメージングシステムは今後の研究に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。