Intracellular Ca(2+) plays a central role in controlling numerous cellular processes such as exocytosis, gene transcription, cell proliferation, muscle contraction and cell survival. The versatile spatiotemporal Ca(2+) dynamics has been considered to be responsible for the regulation of such diverse cellular functions. The level of intracellular Ca(2+) is determined by the balance between the influx that introduces Ca(2+) into the cytoplasm and the efflux that removes it from the cytoplasm. The key molecules involved in the regulation of intracellular Ca(2+) such as channels, pumps and exchangers have been identified. Channels in the plasma membrane and sarco/endoplasmic reticulum (SR/ER) membrane are responsible for the Ca(2+) influx, while pumps and exchangers carry out the Ca(2+) efflux.

Sarco/endoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase (SERCA) is a Ca(2+) pump that transfers Ca(2+) from the cytosol to the lumen of the SR/ER at the expense of ATP hydrolysis. The role of SERCA is pivotal for maintaining intracellular Ca(2+) homeostasis and determining the spatiotemporal pattern of Ca(2+) signals. Indeed, impairment of SERCA causes Ca(2+) homeostatic dysfunction resulting in several important disease states such as heart failure, hypertension, diabetes, cancer, Alzheimer's disease and psychiatric disorder.

The sequential conformational changes of SERCA are accompanied by active transport of 2 moles of Ca(2+) across membranes per 1 mole of bound ATP; the conformational changes of SERCA are directly linked with its activity. Since the three-dimensional structures of the different conformational states have been solved, the detailed mechanism of the reaction cycle of SERCA is known. Traditionally, SERCA pump activity has been approximated by a simple Michaelis-Menten equation as a function of the cytosolic Ca(2+) concentration with a Hill coefficient of 2. Almost all the theoretical models for intracellular Ca(2+) dynamics use this approximation. However, it remains to be elucidated whether the actual enzymatic activity of SERCA pumps in living cells is identical to that of previous in vitro and dynamics of SERCA activity in living cells is still unknown.

In this study, we addressed this issue by applying an optical technique to monitor SERCA activity in living cells. We have developed a FRET-based SERCA2a activity sensor, designated F-L577, which retains the ATP-dependent Ca(2+) pump activity. We demonstrated that the FRET efficiency between donor and acceptor of F-L577 was dependent on the conformational state of the molecule by state fix experiment and confirmed that the FRET signal changes of F-L577 directly reflect the instantaneous Ca(2+) pump activity in living cells by ER luminal Ca(2+) imaging. Using F-L577, we succeeded in visualizing the conformational changes of SERCA2a that accompany ATP-dependent Ca(2+) transport. Dual imaging of cytosolic Ca(2+) and the FRET signals of F-L577 in living cells revealed that SERCA2a activity is coincident with the oscillatory cytosolic Ca(2+) concentration changes evoked by ATP stimulation. These results comprise the first experimental evidence for oscillatory SERCA activity synchronized with Ca(2+) oscillation in living cells. Further, the SERCA dynamics measured by whole cell imaging revealed that, the activity of SERCA2a in living cells can be expressed by a function of the cytosolic Ca(2+) concentration. Notably, in my experimental system, the Hill coefficient was estimated to be 6.8, rather than 2 (the value expected given 2 Ca(2+) binding sites). The cooperative dependence of Ca(2+) pumps on cytosolic Ca(2+) is an important parameter for the generation of complex patterns of Ca(2+) signals, such as Ca(2+) oscillations, because small changes in this parameter have a large impact on the behavior of Ca(2+) dynamics in theoretical models. As found for the action potential, which is generated by the combination of opposite membrane potential changes promoted by fast voltage-gated sodium channels and slowly activated voltage-gated potassium channels, cytosolic Ca(2+) spikes may be generated by the ingenious balance of Ca(2+) influx and Ca(2+) efflux promoted by Ca(2+)-release channels and Ca(2+) pumps, respectively. Therefore, revealed high cooperativity provide us with evidence to reconsider not only the SERCA pump activity but also the Ca(2+) release activity in living cells for better understanding of the mechanism underlying the generation of Ca(2+) dynamics.

Our new findings indicate that the activity of SERCA2a is markedly dependent on the cytosolic Ca(2+) concentration, and that SERCA2a acts as a rapid switch to refill Ca(2+) stores efficiently in living cells for shaping the intracellular Ca(2+) dynamics and for reducing its cytotoxicity. The F-L577 protein constructed in this study will be useful for future studies on Ca(2+) signaling in normal and abnormal cellular processes that involve SERCA pump activity and provide significant insight into the regulatory mechanism of SERCA activity in living cells.

本研究では、生細胞において様々な生理機能を司る細胞内カルシウムダイナミクスの制御機構を解明するべく、細胞内カルシウムの恒常性に最も寄与して細胞機能発現に重要な役割を担っていると考えられている小胞体カルシウムポンプ(SERCA ポンプ)に着目した。生細胞内における SERCA ポンプの働きを明らかにするため、SERCA ポンプの活性を生細胞内でリアルタイムに可視化することができて、さらに、既存のチャネル測定法やカルシウムセンサーと同時に用いることのできる FRET (蛍光エネルギー移動) baseのSERCA センサーを開発した。本研究は、この開発した SERCA センサーを哺乳類細胞株であるアフリカミドリザル腎臓由来(COS7)細胞に発現させ、生細胞内の動的環境(カルシウム振動)下における SERCA ポンプの活性可視化及び解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1. SERCAに2つの蛍光物質を融合させ、FRET 技術を用いて、SERCA ポンプの活性変化に伴う構造変化をFRET 効率の変化として捉えることのできる複数のセンサーの作製を試みた。本研究では、心臓病の原因遺伝子であるとともに癌や神経変性疾患との関わりが報告されている SERCA2aを用いた。FRETのドナーとして ECFP(青色蛍光蛋白質)を、アクセプターとして Venus (黄色蛍光蛋白質)または FlAsH(Tetra cystein tag : TC-tagに特異的に結合する小さい蛍光物質)を用いた。結果、SERCAの作用薬や阻害薬に応じて大きな FRET 変化を示し、発現した細胞で正常なカルシウム振動が観察された F-L577(SERCA2aの577番目のアミノ酸の後にTC-tagを挿入したもの)が SERCA センサーとして働きうることが示された。

2. F-L577の細胞内局在を調べたところ、F-L577は小胞体に正しく局在し、Photobleaching 等の結果から、F-L577 自身で FRET が起こっていることが示された。また、F-L577を発現させた昆虫細胞 (Sf9) から得た小胞体画分を用いて行った in vitro kinetic assayにより、F-L577 自身が ATP 加水分解能を伴い、カルシウムを取り込む SERCA ポンプ活性をもつことが示された。

3. SERCA ポンプは活性変化に伴い E1-Ca、E1-ATP、E2P、E2という主要な4つの構造を取る。F-L577のFRET signal が SERCA ポンプのどのような構造変化を反映しているのかを示すため、F-L577を発現させ膜透過性処理をほどこした細胞を、構造固定溶液で各構造に固定し、FRET signalを測定した。結果、E1-Ca・E1-ATP・E2P・E2の順に、7, 12, 6, -2%のFRET 変化が観察され、F-L577 が SERCAの構造変化をFRET signalの変化で検出できる(F-L577の示す FRET signal が SERCAの構造変化を反映している)ということが示された 。

4. F-L577の活性と構造変化の関係を知るために、FRETと小胞体内腔のカルシウムの同時イメージングを行った結果、F-L577のFRET signal が SERCA 活性と相関し、観察される F-L577のFRET 変化が SERCA ポンプの時々刻々のカルシウムポンプ活性を反映していることが示された。

5. FRETと細胞内カルシウムの同時イメージングにより、F-L577を用いてカルシウム振動中のSERCA ポンプ活性を測定し、カルシウム振動をSERCA ポンプがどのように制御しているのかを調べた結果、SERCA ポンプが細胞内カルシウムと同期して振動することが示された。さらに、SERCA ポンプが細胞内カルシウム濃度に対して高い協同性をもつことが示され、今まで in vitroの研究から考えられていたものより生細胞内で働く SERCA ポンプは、カルシウム濃度の変化に対する活性変化が急峻で、細胞内カルシウムの恒常性を保つためのスイッチのように働いていると考えられた。

以上、本論文ではSERCAセンサーの開発、リアルタイムSERCAポンプ活性測定法の確立に成功し、細胞内カルシウムとSERCAポンプの同時イメージングの結果から、SERCAポンプが細胞内カルシウムと同期して振動すること、SERCAポンプが細胞内カルシウム濃度に対して高い協同性もつこと、を示し、細胞内カルシウム濃度上昇時に恒常性を保つため、SERCAポンプが急激に活性を増加させ、細胞内カルシウム濃度を速やかに減少させる働きがあることを明らかにした。本研究は、生細胞内のカルシウム振動という動的環境下において、これまで未知に等しかった、細胞内カルシウムダイナミクスを司るSERCAポンプの働き、構造機能相関の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。