Fear is exhibited by all mammals, and appears to be part of a universal survival strategy. It is known that the amygdala is the center for the acquisition, storage, and expression of fear memory (LeDoux, 2000). The lateral (LA) nucleus of the amygdala receives a pair of sensory information of conditioned (tone) and unconditioned (electric shock) stimuli, and the association of these coincident inputs is considered to be stored as long-term potentiation (LTP) at thalamo-LA synapses. Emotionally arousing experiences recruit hormone secretion and excite neuromodulatory systems, whereby enhances response to fear or fear conditioning (Rodrigues, 2009). In fact, behavioral studies have shown that cholinergic or catecholaminergic activation enhances amygdala-dependent aversive experience (IntroiniCollison, 1996; McGaugh, 2004). However, reported effects of neuromodulators on amygdalar synapses are diverse and not yet conclusive (reviewed in Pape, 2010). Therefore, it is important to examine the effects and mechanisms of neuromodulation on basal synaptic transmission in LA principal neurons to promote the understanding of how emotional arousal or attention influences fear-related behaviors.

Using coronal slices containing the amygdala of C57BL/6J male mice (Fig. 1), I recorded excitatory postsynaptic currents (EPSCs) from principal neurons in the dorsal subdivision of the LA by stimulating thalamic afferent fibers. Whole-cell voltage-clamp recordings were made at -80 mV in the presence of picrotoxin in order to ensure excitatory currents. First, I found that application of cholinergic agonist carbachol (CCh) induced transient suppression of the amplitudes of evoked EPSCs while increasing paired pulse ratio (PPR) (Fig. 2). Furthermore, miniature EPSC frequencies decreased in the presence of CCh (Fig. 3). These results strongly suggested that CCh acts mainly on presynaptic terminals and suppresses vesicle release. I next examined which type of acetylcholine receptors (AChRs) was responsible for this suppression and whether the site of action was pre- or postsynaptic. Pharmacological manipulation and genetic ablation of muscarinic AChRs revealed that CCh directly acted on muscarnic M4 receptors on the presynaptic terminals (Fig. 4, 5). In addition, N-type voltage-dependent calcium channel (VDCC) was a target inhibited by M4 receptor downstream signaling (Fig. 6). CCh-induced suppression of EPSCs remaining in the presence of N-type VDCC blocker could be due to direct inhibition of vesicle release machinery as shown in hippocampus where muscarinic activation of Gi/oα inhibited PKA-dependent phosphorylation of SNARE proteins and thereby modulated release machinery (Chheda, 2001). Taken together, cholinergic activation might have two distinct sites of action: vesicle release machinery and N-type VDCC (Fig. 10A).

Next, I examined the effects of norepinephrine (NE) and dopamine (DA) on basal synaptic transmission at thalamo-LA synapses. I found that NE with affinity for both αAR and βAR suppressed AMPAR-mediated EPSCs as well as NMDAR-mediated EPSCs and enhanced PPR (Fig. 7), suggesting that NE was a negative modulator presumably by suppressing presynaptic release. In contrast, activation of βAR with isoproterenol increased AMPA-EPSC amplitudes without changing PPR (Fig. 8). These results suggested that presynaptic αAR played a predominant role in adrenergic suppression under physiological conditions, and also demonstrated that αAR and βAR had opposing roles in excitatory transmission at thalamo-LA synapses. Finally, I found that DA also suppressed excitatory synaptic transmission (Fig. 9). Intriguingly, receptors at presynaptic terminals for the neuromodulators I examined are M2 and M4 receptors, α2ARs, dopamine D2 receptors, all of which are coupled to Gi/o proteins, implying the existence of a common mechanism for presynaptic suppression (Fig. 10B).

My finding that neuromodulators induced suppression of excitatory neurotransmission between thalamus and LA principal neurons seems to be contradictory to a number of previous reports that suggested the enhancement of LTP induction by neuromodulators. Knockout mice of M2 receptor demonstrated stronger disinhibition of GABAergic than glutamatergic transmission (Seeger, 2004). The application of DA or NE gated LTP induction at thalamo-LA synapses by suppressing GABAergic inputs (Bissiere, 2003; Tully, 2007). Thus, suppression by neuromodulators of presynaptic function and excitatory transmission at thalamo-LA connections may be outweighed by concomitant disinhibition of inhibitory neurons allowing the enhancing LTP induction.

本研究は、恐怖を始めとする情動を担う神経核である扁桃体が調節されるメカニズムを明らかにするため、マウスの扁桃体外側核において、神経修飾物質であるアセチルコリン、ノルエピネフリン、ドーパミンの作用機構の電気生理学的解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1. C57BL/6Jマウスから扁桃体を含むスライスを作成し、扁桃体外側核の興奮性ニューロンであるプリンシパル・ニューロンをホールセルパッチし、GABAA受容体のアンタゴニストであるピクロトキシン存在下で、視床からの入力線維を刺激することにより、興奮性シナプス後電流を記録した。アセチルコリン受容体アゴニストであるカルバコールを投与したところ、興奮性シナプス後電流が減弱した。またカルバコールによってグルタミン酸を含むシナプス小胞の放出確率が減少したこと、微少興奮性シナプス後電流の頻度が減弱したこと、記録電極にGTPase阻害剤であるGDPβSを加えて記録する細胞のGTPの効果を抑制した状態ではカルバコールによる興奮性シナプス後電流の減弱には変化がなかったことから、カルバコールはシナプス前終末に作用して視床―扁桃体外側核の興奮性シナプス伝達を減弱することが示された。

2. ムスカリン性アセチルコリン受容体のアンタゴニストであるアトロピン存在下では、カルバコールによる興奮性シナプス後電流の減弱効果は観察されなかった。また、ムスカリン性アセチルコリン受容体のサブタイプ4ノックアウトマウスでは、カルバコールによる興奮性シナプス後電流の減弱効果は小さくなり、ムスカリン性アセチルコリン受容体のサブタイプ2と4のダブルノックアウトマウスでは、カルバコールによる興奮性シナプス後電流の有意な減弱効果は観察されなかった。このことから、カルバコールによる興奮性シナプス後電流の減弱は、ムスカリン性アセチルコリン受容体のサブタイプ4が主に担っていることが示された。

3. N型電位依存性カルシウムチャネルのアンタゴニストであるコノトキシンを投与したところ、視床―扁桃体外側核の興奮性シナプス伝達は減弱した。さらにカルバコールを投与したところ、興奮性シナプス後電流の減弱が小さくなったことから、カルバコールによる興奮性シナプス後電流の減弱は、N型電位依存性カルシウムチャネルが少なくとも関与していることが示された。

4. ピクロトキシンフリーの状態でAMPA受容体およびカイニン酸受容体のアンタゴニストであるCNQX、NMDA受容体のアンタゴニストであるAPV存在下で、視床―扁桃体外側核の抑制性シナプス後電流を記録した。カルバコールを投与したところ、抑制性シナプス後電流は減弱し、その減弱は興奮性シナプス後電流の減弱と同程度であった。

5. 視床―扁桃体外側核の興奮性シナプス後電流を記録しているところにアドレナリン性受容体のアゴニストであるノルエピネフリンを投与したところ、興奮性シナプス後電流は減弱した。また、βアドレナリン性受容体のアゴニストであるアイソプロテレノールを投与したところ、興奮性シナプス後電流は増大した。このことから、ノルエピネフリンは、αアドレナリン性受容体を介して興奮性シナプス伝達を減弱させると同時に、βアドレナリン性受容体を介して興奮性シナプス伝達を増大させる、という両方向性の効果をもつことが示された。

6. 視床―扁桃体外側核の興奮性シナプス後電流を記録しているところにドーパミンを投与したところ、興奮性シナプス後電流が減弱した。以上より、アセチルコリン、ノルエピネフリン、ドーパミンはいずれも視床―扁桃体外側核の興奮性シナプス伝達を抑制させることが示された。

以上、本論文は扁桃体外側核において、アセチルコリン、ノルエピネフリン、ドーパミンの興奮性シナプス伝達における効果、またその作用機序を明らかにした。本研究は、まだ不明な点が多い、扁桃体外側核の神経ネットワークの解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。