Background: There has been considerable controversy over whether the glomerular basement membrane (GBM) or the slit diaphragm is the most important restriction barrier of glomerular filtration of proteins. Electron microscopy studies visualizing the "zipper structure" of the slit diaphragm and the discovery of many slit diaphragm proteins such as nephrin, whose deficiency leads to nephrotic syndrome has led many to believe that the slit diaphragm is the main filtration pathway for serum proteins in both physiological and pathologic states. However, the number of slit membranes is reduced and slit diaphragms are altered to a tight junction-like structure in minimal change nephrotic syndrome in spite of massive proteinuria, suggesting other pathways of protein filtration. We have obtained results suggestive of non-slit diaphragm routes for albumin filtration in previous studies.

In this study, we aimed to elucidate the glomerular filtration pathways of albumin with various methods. We utilized 2nm thiocyanate gold which can be clearly detected by electron microscopy with silver enhancement, and Evans blue dye, which strongly and specifically binds to albumin, as tracers for albumin, and were able to observe the passage of albumin through the glomerulus and speculate the filtration pathways of proteins in detail.

Methods: Nephrotic syndrome was induced by intraperitoneal injection of puromycin aminonucleoside (PAN). Kidney specimens from PAN rats and controls were obtained after intravenous administration of 2nm gold-labeled albumin, fixed by glutaraldehyde and examined on electron microscopy following silver enhancement. To visualize the glomerular filtration pathway of albumin, We continuously infused rats with Evans blue-labeled human serum albumin (EB-HSA), and examined the glomerular filtration of albumin by confocal microscopy of kidney lowicryl sections, immunogold scanning electron microscopy (SEM) of kidney vibratome sections, and clearance measurement.

To elucidate whether the production of reactive oxygen species (ROS) by NADPH oxidase in podocytes is involved in the pathophysiology of this disease model, we performed pre-embedding immunocytochemistry for NADPH oxidase and cerium chloride histochemistry. We also tested the effects of apocynin, a NADPH oxidase inhibitor.

Results: Few 2nm gold particles were observed in the the GBM, and between foot processes and tubular epithelial cells in control rats, while rarely seen under the slit membrane. In contrast, in PAN rats, increased gold labeled albumin uptake was observed in the paramesangial areas and podocyte cell bodies. EB-HSA was observed in the podocytes of PAN rats by confocal microscopy, and urinary EB-HSA excretion showed a 132-fold increase compared to controls. Immunogold-SEM showed a clear increase in the number of albumin molecules in podocyte vesicles (33.3±6.0 vs. 0.3±0.2 particles per podocyte cross section, p <0.01) and on the podocyte apical membrane (113.8±21.3 vs. 5.2±0.8 particles per micrograph, p <0.01), suggesting that a endocytic pathway for albumin is enhanced in the podocyte of nephrotic rats. With apocynin treatment, the number of gold particles localizing EB-HSA was significantly decreased with reduced podocyte superoxide production and urinary EB-HSA excretion. Immunoprecipitation of isolated glomeruli with anti-FcRn antibody showed a considerable increase in albumin bound to FcRn in PAN rats, which decreased in apocynin-treated PAN rats,

Conclusion: In conclusion, we have demonstrated that an albumin filtration pathway through the podocyte cell body via endocytosis and exocytosis mediated by FcRn may exist, resulting in selective albuminuria. Overproduction of ROS by NADPH oxidase precedes the onset of proteinuria, and NADPH oxidase inhibition with apocynin suppressed podocyte albumin endocytosis and exocytosis and ameliorated proteinuria, shedding light on apocynin as a new therapeutic approach for the nephrotic syndrome.

本研究はネフローゼ症候群の代表的な原因疾患である微小変化型ネフローゼ症候群において、アルブミン主体の選択的蛋白尿が見られることに着目し、同疾患における糸球体内の特異的なアルブミン濾過経路の存在を検証すべくPuromycin aminonucleoside (PAN) ネフローゼラットを用いて種々の解析を行い、またNADPH oxidase阻害剤apocyninの効果について検討したものであり、下記の結果を得ている。

1.slit poreを通過可能な2nm thiocyanate gold標識アルブミンを対照・PANラットに静注し、電顕的に直接糸球体濾過の経路を観察したところ、アルブミンは内皮・パラメサンギウム、足細胞に取り込みが認められ、スリット膜以外の濾過経路の存在が示唆された。一方、PANラットでは癒合した足細胞に取り込まれるアルブミンが増加していた。

2.アルブミンと特異的に結合するEvans blue色素をヒトアルブミンに結合させ(EB-HSA)、対照・PANラットに静注した。光顕ではPAN腎症で糸球体のEB-HSA取り込みの増加が示された。clearance測定を施行し、PAN腎症では対照に比しEB-HSAのfractional excretionが約130倍に亢進し (p<0.01 vs. control)、蛋白尿も著明に増加した。SDS-PAGEとdensitometryによりPANラットの尿蛋白はアルブミン主体で選択性の高いことが示された。Microdissectionで単離した糸球体を用いwestern blottingを行ったところ、PAN腎症のラットではEB-HSA取り込みの増加を認めた。共焦点顕微鏡ではEB-HSAは足細胞内に局在することが示された。

3.対照,PANラットにEB-HSAを静注し、腎臓のvibratome切片に対してImmunogold SEM法を用いて電子顕微鏡下に糸球体でのアルブミン濾過経路を観察した。対照群ではsilver enhanceされた金粒子はスリット膜上の足突起間の間隙に少数認められた。これに対し、PANラットでは多数の金粒子が足細胞内のvesicleと足細胞の表面に散見された。高倍率のsecondary electronモードによる観察ではPANの足細胞表面にexocytosisを想起させる多数の粒状の隆起が見られた。これらの結果よりアルブミンが足細胞にendocytosisで取り込まれ、細胞質内を通過する経路で濾過されると考えられた。

4.PAN腎症の機序にはreactive oxygen species (ROS) が関与するとされており、これを検証した。免疫組織化学・免疫電子顕微鏡法を施行し、PAN腎症で足細胞においてNADPH oxydaseのsubunitであるp47phoxの発現が増加していることが示された。またcerium chloride histocytochemistry法にて、PANラットではPAN投与後2日目に足細胞のROS産生増加が示された。尿中H2O2濃度を測定したところ、PAN静注後2日目で最大となり、蛋白尿や足突起癒合の出現に先行した。

5.NADPH oxidase阻害剤apocyninのPAN腎症における効果に関し検討した。Apoocynin経口投与により無治療群に比しEB標識アルブミンのfractional excretion及び蛋白尿の有意な改善が認められた。Immunogold SEMでは無治療群に比し足細胞内vesicleと足細胞膜表面の金粒子数は有意に減少した。またapocyninはPANラットにおける尿中H2O2の上昇を抑制した。Apocyninがネフローゼ症候群においてアルブミンのendocytosisを抑制し、蛋白尿を減少させる可能性が示唆された。

6.足細胞膜上に発現するアルブミン受容体であるFcRnに対する抗体を用いmicrodissectionで単離した糸球体を用いた免疫沈降法を施行したところ、PANラットにおいてFcRnと結合したヒトアルブミンの著明な増加が示された。これはapocynin経口投与にて有意な減少を認めた。FcRnを介したアルブミンの特異的な濾過経路の存在が示唆された。

7.green fluorescent protein (GFP)-transgenicラットを用い、共焦点顕微鏡でアルブミンの糸球体内動態をreal-timeで検討した。PAN腎症において近位尿細管中にアルブミンが出現したのは静注後5分以降であった。対照において近位尿細管中のアルブミンはわずかに認められたのみであった。結果よりPAN腎症でアルブミンの大半が足細胞内をendocytosisにより輸送される可能性が高いことが示された。

以上、本論文は微小変化型ネフローゼ症候群の動物モデルにおいて、免疫電子顕微鏡法を中心とした種々の解析からネフローゼ症候群の蛋白尿の発症機序として、FcRn受容体を介して足細胞がアルブミンを特異的にendocytoseし、細胞質内を通過する新たなアルブミン濾過経路の存在を明らかにした。またNADPH oxidase阻害剤apocyninによりこの経路が抑制され、有望なtherapeutic drugであることを示した。本研究はこれまで原因不明であった微小変化型ネフローゼ症候群の病態生理の解明、新たな治療の開発に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。