Hypertension continues to be a major public health problem and contributes to deaths from stroke, myocardial infarction, and kidney failure. A high prevalence of hypertension is seen in populations with high dietary salt intake. For several decades' studies, the activation of the renal sympathetic nervous system has long been suspected to play a key role in the development of salt-induced hypertension through sodium retention, for example, a recent clinical study showed that renal denervation with catheter-induced electrical ablation markedly decreased blood pressure in patients with resistant hypertension (Krum H, et al. Lancet 373:1275-1281, 2009). However, the precise molecular mechanism for sympathetic activity induced sodium retention still remains unclear. It is especially unknown what factors mediate the inter-individual variation in salt sensitivity of blood pressure. Recent studies have shown that the serine-threonine kinases with-no-lysine (K) (WNK) play an important role in renal tubular sodium re-absorption. Among WNKs, WNK4 which is expressed in the distal nephron, have the ability to inhibit renal sodium channels, the Na+-Cl- co-transporter (NCC) and the epithelial Na+ channel (ENaC), to express in cell membrane, thus prevent NCC and ENaC mediated sodium re-absorption in the distal nephron in kidney. On the other hand, an inactive mutation of WNK4 had been proved as the cause of pseudohypoaldosteronism type II (also known as Gordon's syndrome), due to sodium over-re-absorption through the hyper-activated sodium channels.

This study, for the first time, has demonstrated that epigenetic modulation is essentially involved in the development of salt-sensitive hypertension, which is attributable to aberrant β-adrenergic receptor-WNK4 pathway in the kidney. By using in-vivo mice model, the current study I clarified that β2-adrenergic receptor (β2-AR) stimulation inhibited renal WNK4 expression, thus up-regulated sodium channel NCC and ENaC and finally caused salt-sensitive hypertension via sodium retention. Moreover, in-vitro experiments by using mouse (m) DCT cells, demonstrated glucocorticoid receptor (GR) activation is essential in β2-AR induced WNK4 inhibition. That GR binding to the negative GR element (nGRE) in the WNK4 promoter region mediate the inhibition of WNK4 transcription, and this binding was enhanced by β2-AR stimulation. Furthermore, the mechanism of β-stimulation induced enhancement of GR and nGRE binding in WNK4 promoter was clarified. β-AR stimulation through the cAMP-PKA pathway phosphorylated Histone deacetylase (HDAC) 8. This phosphorylation reduced HDAC8 activity, removed it from histones, and induced to hyper-acetylation of histones embedded in WNK4 promoter. Resultantly, the acetylated histone provided relaxed chromatin allowed more GR binding to the nGRE to further suppressed WNK4 transcription. I proved the above process in two rodent models of salt-sensitive hypertension: in an acquired model, DOCA-salt rats and a classic genetic model Dahl salt-sensitive rats. In DOCA-salt model, the increased renal sympathetic activity down-regulated WNK4 expression and resulted in salt-induced hypertension. Renal denervation could recover the renal WNK4 expression thus return the blood pressure to normal. In Dahl salt-sensitive rats, using renal denervation and mineralocorticoid receptor (MR) blocker together also returned elevated blood pressure to normal. Which suggesting sympathetic activation and MR activation are two separated systems that both contribute to salt-induced hypertension in this model.

Taken together, this study suggested that salt loading increases renal sympathetic activity in salt-sensitive animals, and as a result, β2AR-stimulation induces histone modulation of the WNK4 promoter containing nGRE. The increased GR-nGRE binding results in decrease in WNK4 expression, activates NCC activity, leading to sodium retention and the development of salt-sensitive hypertension. Thus, the β2AR-WNK4 pathway in the kidneys can serve as an alternative target for the treatment of salt-sensitive hypertension. And this work provides useful information that can lead to a new therapeutic strategy of salt-sensitive hypertension based on its pathogenesis.

本研究は腎交感神経活動と食塩感受性発症の詳細なメカニズムを明らかにするため、動物モデルやマウス遠位尿細管細胞を用い、交感神経刺激による、遠位尿細管の塩分再吸収チャネルNCC(Na+/Cl- cotransporter)の活性化とそれにともなうナトリウムの再吸収、循環血漿量の増加と血圧の上昇の関係を明らかにした。更に、交感神経刺激による、NCCチャネルが活性化されるメカニズムについて、遠位尿細管に局在する酵素WNK4の関与とWNK4の転写調節の解析を試みたものであり、下記の結果を得ている。

1、動物モデルで交感神経刺激による食塩感受性高血圧を発症した。野生型とβ1受容体欠損マウスではイソプロテレノール(ISO)刺激下で低食塩に比し高食塩食では血圧が上昇し、低食塩食に戻すと血圧が低下した。同時にWNK4の発現が低下し、NCC、ENaCのたんぱく量とNCCのリン酸化が亢進を確認した。このような変化はβ2受容体欠損マウスでは認められなかった。一方PKA阻害剤ではWNK4の発現抑制が解除され、テオフィリンによりWNK4の発現はさらに低下した。DOCA食塩ラットではWNK4の発現が低下したが、腎除神経により血圧およびWNK4発現が正常化した。

2、charcol処理した血清ではISOによるWNK4の転写は抑制されなかった。このことは血清中のステロイドがβ2受容体によるWNK4抑制に関与することを示唆するものである。今回の検討ではRU486でISOの作用が抑制されたことからWNK4がGR(glucocorticoid receptor)により抑制されると考えた。実際WNK4のプロモーターにはGRにより抑制的に制御されるエレメント(nGRE, negative GR responsive element)があることがプロモーターアッセイで明らかとなった。また、この部位を対象にしたChIPアッセイでもISOはGRとnGREの結合を増強させ、さらにWNK4を抑制することが明らかになった。また腎臓でのGR欠損マウスではISO及び食塩負荷による血圧上昇が認められなかった。

3、β2受容体活性化によって、HDAC(Histone-deacetylase)8がリン酸化し、活性を抑制された。それでWNK4プロモーター近傍のヒストン3,4のアセチル化が有意に増加し、GRとnGREの結合が増強するメカニズムを確認した。HDAC8リン酸化サイトの変異による、HDAC8の活性、ヒストンのアセチル化、GR-nGRE結合とWNK4転写の改善を認めた。

4、食塩感受性モデルDahlラットと交感神経興奮モデルDOCA食塩ラットを用いて、交感神経興奮と食塩感受性発症の関連をさらに証明した。腎除神経したラットでは食塩負荷により血圧の上昇を認められなかった。

以上、本論文はβ2受容体刺激がGRの作用をヒストン3,4のアセチル化を介して増強させることでWNK4の発現を抑制し、その結果としてENaC, NCCが亢進し食塩感受性を亢進させることを示した。本研究ではさらにβ2受容体によるヒストンアセチル化のメカニズムを明らかにし、食塩感受性高血圧の新たなメカニズムを解明した。今回の検討からβ2受容体刺激はヒストンのアセチル化を介して核内受容体の転写活性とクロストークし、その結果として食塩感受性高血圧を発症させる可能性示された。Epigenetic変化が食塩感受性高血圧治療の新しい目標になると考えられ、学位授与に値するものと考えられる。