Inactivating mutations of V2 vasopressin receptor result in X-linked congenital nephrogenic diabetes insipidus (NDI), causing renal resistance to the antidiuretic hormone, AVP. Although many mutations cause the complete loss of protein expression and thus complete phenotype, some unique mutations cause partial phenotype may suggest how the GPCRs work normally. In two families showing partial NDI, which had been originally diagnosed as psychogenic polydipsia, we have identified two V2 receptor mutations, S333del and Y128S and analyzed them together with other mutations. Both mutant V2 receptors, when expressed in COS-7 cells, showed partial defect in vasopressin-stimulated cAMP accumulation. They predominantly showed intracellular localization with diminished cell-surface expression. Inhibition of internalization by dominant negative dynamin or addition of 362X mutation to V2 receptor mutations did not rescue their localization and function. Non-peptide V2 receptor antagonists partially rescued membrane localization and basal function of these V2 receptor mutants although they inhibited basal activity of wild type V2 receptor. These results suggest that partial loss of function of S333del and Y128S mutant V2 receptors results from defective membrane localization rather than constitutive internalization. These results also suggest that V2 receptor antagonists show protean agonism, serving as pharmacological cheperon to inactivating V2 receptor mutants and yet serving as inverse agonists to wild type receptors. If we could develop V2 receptor ligands that can restore membrane localization of V2 receptor mutants but do not inhibit agonist action or work as agonists by themselves, they might become useful drugs for investigating receptor kinesis and for treating NDI.

本研究は、疾患の解析から、多様な機能を持つシグナル伝達系であるGPCRおよびGタンパク質の働きを明らかにするため、先天性の腎性尿崩症の症例において、原因遺伝子の一つであるvasopressin V2 受容体の遺伝子変異の確認を行い、変異タンパク質の機能解析を行ったものであり、下記の結果を得ている。

1.部分腎性尿崩症の2症例からDNA塩基配列の解析の結果、2種類のV2受容体の変異が同定された。1種類はY128Sと言う変異で、完全な腎性尿崩症として既報の変異であったが、本研究では部分腎性尿崩症の表現型を示し、部分腎性尿崩症としての報告は初めてであった。もう一種類の変異は、新たな変異でS333delという3塩基1アミノ酸の欠失であった。

2.COS7に変異受容体をover expressionし、AVP刺激に対するcAMPの蓄積を測定し、機能解析を行った。同時に、2005年にFeldmanらによってNSAID(nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis)の原因として報告されたgain of functionの変異であるR137L、また同部位にも関わらずloss of functionの変異であるR137H、部分腎性尿崩症の表現型をとるS329Rについても同時に解析し比較した。cAMP assayの結果から、R137LはAVP刺激なしでも、wild typeのV2受容体と比較してベースの活性化が認められるgain of functionの変異であり、R137HはcAMPの蓄積が減弱しており最大限刺激してもwild typeのベースの活性化程度でありloss of functionの変異であることに合致する結果と考えられた。また、S333del、Y128S、S329RもcAMPの蓄積は減弱していたがAVP刺激によりある程度の蓄積は認められることからpartial loss of functionの変異であることに合致する結果と考えられた。

3.変異受容体タンパク質の局在を免疫染色及びcell surface ELISAで確認したところ、wild typeと比較して、R137H、S333del、Y128S、S329Rの変異受容体は膜での発現量が低下していた。R137Lの変異受容体は、膜での発現量の低下は軽度であった。膜での発現量の低下の原因として、traffickingの問題またはinternalizationの問題の可能性を考えた。internalizationを阻害する、V2受容体の362x(362番以降の欠失)およびDominant Negative Dynaminを使い、膜の発現量に対するinternalizationの影響を確認した。R137LおよびR137Hでは膜での発現量が増加したが、S333del・Y128S・S329Rでは膜での発現量は増加を認めず、後者の3種類の変異はinternalizationの問題よりはtraffickingの問題があることが示唆された。

4. OPC3またはOPC4と言うシャペロン効果があるといわれている薬剤で変異受容体のtraffickingを補助したところ、免疫染色・Cell surface ELISAともに膜での受容体の発現量の増加を認めた。

5. OPC3およびOPC4で、変異受容体の膜の発現量が大幅に増加したため、発現量の増加により機能低下を補うことが出来る可能性を考え、OPC3またはOPC4存在下でのcAMPの蓄積を確認した。Wild typeのV2受容体に対してはcAMPの蓄積を減弱させたのに対して、R137H・S333del・Y128S・S329Rでは膜の受容体の発現量増加の影響か、cAMPの蓄積は増加していた。即ち、wild typeの受容体に対してはinverse agonist作用を示し、loss of functionの変異受容体(R137H・S333del・Y128S・S329R)に対してはagonist作用を示すという、受容体の状態によって異なる作用を示した。この結果は、protean agonismの一例と考えられた。

以上、本論文はヒトの部分腎性尿崩症から同定されたV2受容体の変異を同定し、その機能解析を行った。その結果、受容体の状態に応じてリガンドが働きを変え得ることを示した。

本研究はこれまでほとんど実例がなかったprotean agonismの一例を示している。今後の創薬においてもこのprotean agonismという概念は重要になってくると考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。