Recently two novel members of the globin superfamily, neuroglobin (Ngb) and cytoglobin (Cygb), were discovered. In contrast to conventional globins such as hemoglobin (Hb) and myoglobin (Mb), Ngb and Cygb display a functionally-relevant hexa-coordinate heme iron atom. While Ngb is predominantly expressed in nerve cells, Cygb is expressed in fibroblast cell lineage distributed in various organs. However, its function remains unknown.

In order to study the expression of Cygb in the kidney of rats, we made rabbit polyclonal antibodies against rat Cygb. Immunohistochemical staining with these antibodies showed the expression of Cygb in interstitial fibroblasts of the normal kidney and the remnant kidney (RK) model, a model of renal fibrosis. Immunohistochemical analysis showed the up-regulation of Cygb in the interstitial cells in RK. Expression levels of Cygb in RK rats were significantly increased as the disease progressed at both the mRNA and protein levels. The association of Cygb up-regulation with fibrosis was confirmed by using immunohistochemistry for the detection of collagen I and collagen IV. Our morphometric analysis showed that up-regulation of Cygb was associated with an increase in collagen I and IV in the tubulointerstitium of RK. In addition, we observed the expression of Cygb was adjacent to collagen IV deposition areas, suggesting that Cygb expression was correlated with collagen synthesis in interstitial cells in RK.

To investigate the biological role of Cygb in vivo, we established a new transgenic (Tg) rat which overexpressed rat Cygb under the control of a ubiquitous CAGGS promoter. Cygb was expressed in various organs in these rats, including brain, heart, liver and kidney. To investigate the functional consequence of Cygb up-regulation, we induced RK in these animals. As a result, deterioration of renal function over 9 weeks as estimated by serum creatinine levels was ameliorated in Cygb-Tg rats with RK compared with wild type rats with RK. The amount of proteinuria was also less in Cygb-Tg rats with RK than in wild type animals. Evaluation of fibrosis of RK by morphometric analysis of collagen I and IV accumulation showed that transgenic overexpression of Cygb ameliorated fibrosis of the kidney. Protection against fibrosis in Cygb-Tg rats was confirmed by Masson's trichrome staining.

To clarify an anti-oxidative role of Cygb, we transfected kidney fibroblast cell line NRK49F to overexpress Cygb. When Cygb-overexpressing NRK49F cells were treated with hydrogen peroxide, they displayed increased reactive oxygen species (ROS) scavenging activity compared with cells expressing a mock-vector.

In order to investigate the mechanism of amelioration of fibrosis by Cygb in vivo, we used nitrotyrosine as a marker of oxidative stress. Immunohistochemical analysis revealed a decrease in nitrotyrosine accumulation in tubules in RK in Cygb-Tg rats. Urinary 8OHdG as another marker of oxidative stress in Tg rats was significantly reduced compared with wild type animals.

To further clarify the mechanism by which renal fibrosis is ameliorated in Cygb-Tg rats, we established primary cultured fibroblasts from the kidneys of wild type and Cygb-Tg rats. Cygb-Tg rat-derived fibroblasts showed overexpression of Cygb at both the mRNA and protein levels compared with cells derived from wild type animals. Synthesis of collagen I was reduced in fibroblasts from Cygb-Tg rats in both mRNA (73.8%) and protein levels (43.5%) as compared to those in cells from wild type rats. We also established stable transfectants in HEK293T cells in which Cygb can be overexpressed in an inducible manner. The amount of collagen I production measured by ELISA was also reduced in these cells when Cygb expression was induced.

We engineered mutant cells with impaired ability to bind ligands at the heme of Cygb to test whether the heme component of Cygb might be the main contributor to radical scavenging. In contrast to cells overexpressing intact Cygb, the amount of collagen I synthesis by kidney fibroblasts expressing mutated Cygb did not differ from that by control cells.

In conclusion, we demonstrated for the first time that Cygb plays a protective role against fibrotic changes in the kidney both in vitro and in vivo via the amelioration of oxidative stress. Cygb is a fascinating target for therapeutic approaches in a variety of fibrotic diseases, including chronic kidney disease.

本研究は慢性腎臓病において重要な役割を果たす腎尿細管間質の低酸素状態において、腎臓線維芽細胞に発現する新規グロビン蛋白サイトグロビン(Cytoglobin)の役割を明らかにするため、慢性腎不全モデル(6分の5腎摘)を用いてサイトグロビンの抗線維化作用を示したものであり、下記の結果を得ている。

1.サイトグロビンに対するラビットポリクローナルラットを作成し、慢性腎不全モデルの腎尿細管間質におけるサイトグロビン発現量を解析した結果、作成から9週後にサイトグロビンは有意にmRNAレベルおよび蛋白レベルで増加していた。さらに線維化の指標であるCollagen I, Collagen IVも9週後までに同様の増加傾向を示した。サイトグロビンとCollagen IVの2重染色では腎間質に増加したCollagen IVの近傍にサイトグロビンが発現しており、相関があることが示された。

2.サイトグロビンを全身に過剰発現させたトランスジェニックラット(Cygb-Tg)を作成した。トランスジェニックラットに慢性腎不全モデルを作成し、9週後までの腎機能(血清クレアチニン値、尿たんぱく量)、収縮期血圧を測定したところ、血清クレアチニン値は有意にwild typeよりもCygb-Tgのほうが軽減していた。尿蛋白量および収縮期血圧の平均値もTgラットで軽快傾向を認めた。さらに、9週後のwild typeおよびCygb-Tgラットの免疫染色を行い、Collagen I, Collagen IV, Masson's Trichrome Staining, alpha-smooth muscle actin(myofibroblstのマーカー), ED-1(浸潤マクロファージのマーカー)がすべてCygb-Tgラットで軽減していることを確認した。

3.サイトグロビンを過剰発現すると慢性腎不全モデルの腎間質の線維化が軽減するメカニズムを解明するため、酸化ストレスのマーカーであるNitrotyrosineの免疫染色をおこなったところ、Cygb-Tgラットはwild typeより酸化ストレスが軽減していることが明らかになった。さらに酸化ストレスの別のマーカーである尿中8OHdGも同様の結果を得られた。In vitroでは正常ラット線維芽細胞(NRK49F: normal rat kidney cell line 49F)を用いてサイトグロビンを一時的に過剰発現させるとROS(reactive oxygen species)レベルが軽減することを確認した。

4.上記の結果をin vitroにおいて、サイトグロビンを過剰発現させたときにCollagen Iの産生量が軽減されることを示した。まず、wild typeとCygb-Tgラットの腎間質の線維芽細胞を採取し、Primary cultureを行った。WT, Tgのprimary cultured cellsが産生するCollagen Iの産生量をmRNAレベルおよび蛋白レベル(ELISAにて評価)で測定したところ、Tgのほうが有意にCollagen I産生量が低下していた。さらにNRK49Fにサイトグロビンを過剰発現させたときtransient transfection, テトラサイクリン誘導stable cell lineともにCollagen I産生量は過剰発現で軽快した。

5.サイトグロビンの抗線維化作用の分子メカニズムを明らかにするため、サイトグロビン分子の構造の中で酸素と結合能があると推測されるhemeの領域にアミノ酸配列でHistidine→Tyrosineのmutationを入れてサイトグロビンを過剰発現させたところ、Collagen I産生量の軽減効果は消失した。このことからサイトグロビンの酸素結合能が抗線維化作用に関与している可能性が示唆された。サイトグロビンは慢性腎不全に対する抗線維化作用を有する新規グロビン蛋白で、慢性腎不全の治療薬として可能性を有した分子である。

以上、本論文は慢性腎不全の腎尿細管間質に発現するサイトグロビンの解析からその抗線維化作用を明らかにした。本研究は慢性腎不全における新たな治療薬の開発に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。