Lysophosphatidic acid (LPA) is a potent lipid mediator with a wide variety of biological actions including neurogenesis, myelination, angiogenesis, wound healing, and cancer progression. It has been demonstrated that cell-surface G protein-coupled receptors (GPCRs) mediate the effects of LPA, and at least six subtypes of LPA receptors (LPA(1-6)) have been identified. In 2003, Noguchi et al. identified the fourth LPA receptor, LPA4, and subsequent studies have shown that LPA4 couples to Gα13. However, its physiological or pathological roles have not been revealed. In this thesis, I show that LPA4 has important roles in the development of blood and lymphatic vessels.

During the breeding of LPA4-deficient mice, I noticed that the number of LPA4-deficient mice was about 30% less than the value expected from Mendelian ratios at weaning on postnatal day 21. At multiple embryonic stages, a subset of LPA4-deficient embryos displayed various abnormalities in many organs, including pericardial effusion, subcutaneous hemorrhages and/or edema, and bleeding in the pericardial cavities. Furthermore, immunohistochemical analysis of α-smooth muscle actin (α-SMA) revealed that some of the dilated blood vessels in LPA4-deficient embryos were poorly covered with α-SMA+ cells, namely smooth muscle cells and pericytes. Consistently, Matrigel plug assays showed decreased mural cell coverage of endothelial cells in the neovessels of LPA4-deficient adult mice. In situ hybridization detected Lpa4 mRNA in the endothelium of some blood vessels of embryos. These data suggest that the LPA4 signaling pathway in the vascular endothelium is important for blood vessel development, especially for mural cell recruitment to endothelial cells.

The lymphatic vessel abnormalities were also observed in LPA4-deficient embryos. In both edematous and apparently normal LPA4-deficient embryos at embryonic day (E) 14.5, significant dilation of the jugular lymph sacs was observed. Moreover, LPA4-deficient embryos at E18.5 showed lymphatic vessel dilation in the small intestine, lung, and skin. These results indicated that LPA4 is also important for the regulation of lymphatic development and patterning in mice.

In conclusion, I demonstrated a novel role of LPA4 in the formation and function of blood/lymphatic vessels during mouse embryogenesis. Considering the critical role of autotoxin, an enzyme involved in LPA production, and Gα13 in vascular development, I suggest that LPA4 provides a link between these two molecules. Combined with the fact that maturation of blood/lymphatic vessels affects the inherited vascular diseases or tumor progression, LPA4 might be a therapeutic target for such human diseases.

本研究は、マウス発生期においてリゾホスファチジン酸(LPA)第4受容体(LPA4)が血管・リンパ管形成において重要な役割を果たすことを、LPA4ノックアウトマウスと組織学的解析を用いて示しており、下記をはじめとする数多くの結果を得ている。

1.繁殖の過程でLPA4ノックアウトマウスどうしの交配から生まれる仔マウスの数が、野生型マウスどうしの交配から生まれる仔マウスの数よりも統計学的に有意に少ないことが明らかとなった。ヘテロ雌マウスを用いた交配でも、ノックアウトマウスの数が少ないことから、少なくとも胎児側に原因があることが示された。

2.ノックアウト雄マウスと交配した妊娠ノックアウト雌マウスを開腹して観察すると、着床は正常であったが、その後の妊娠期の様々な時点で皮下出血・浮腫等の異常が一部の胎児に認められた。中には致死性を示す胎児が存在し、胎生18.5日(E18.5)で正常に見える仔マウスの数は、野生型マウスどうしを交配した時の約半分であった。

3.様々な妊娠期の観察により、E10.5における心嚢浮腫、E14.5における全身の浮腫や出血、E18.5における皮下出血、心嚢出血、胸腺出血、全身浮腫等が観察されたことから、脈管形成の異常が胎生致死の一因と考えられた。

4.E18.5の胎児の組織染色により、出血を伴うノックアウトマウスでは一部の血管が拡張しており、それらの血管の一部では血管を取り巻くmural cellの減少が認められ、同様の傾向が、成体マウスを用いたマトリゲルの皮下注入により誘発される血管形成のマウスモデルでも認められた。

5.E14.5の胎児の組織染色により、ノックアウトマウスで頚部リンパ嚢が拡張していることが明らかとなった。また、E18.5の組織染色でも、小腸、肺、皮膚などの各臓器で、ノックアウトマウスでリンパ管の拡張がみられた。

6.様々な時期のマウス胎児を用いたin situ ハイブリダイゼーションでは、心臓をはじめとする複数の臓器中の微小血管でLPA4特異的なシグナルが認められた。成体マウス肺より単離した血管内皮細胞でもRT-PCRによりLPA4 mRNAの発現が認められた。また、ヒト初代培養細胞である血管内皮細胞由来のHUVECやリンパ管内皮細胞由来のHMVECといった細胞においても、RT-PCRにてLPA4 mRNAの発現が認められた。

以上、本論文は、LPA4がマウス発生期における血管・リンパ管形成に重要な役割を担っていることを明らかにした。本研究は、これまで生体内における機能が未知であったLPA4の機能をはじめて明らかにしたという点で画期的であり、またリガンドであるLPAが生体内で血管・リンパ管形成に重要であることを示すはじめての報告としても重要である。

上記より、本研究は学位の授与に値するものと考えられる。