【背景・目的】

熱性けいれんは発熱中に起こり、乳幼児が経験する最も一般的なけいれん発作である。熱性けいれんには単純型と複雑型が存在し、前者は良性とされている一方で、後者に関しては、将来的に側頭葉てんかんの発症へ関与する可能性が示唆されている。側頭葉てんかん患者の海馬では、歯状回における顆粒細胞層の形成異常、顆粒細胞の軸索である苔状線維の異常発芽、抑制性神経細胞の死滅、そしてアンモン角における錐体細胞の死滅及びグリオーシスによる海馬硬化などの病理学的変化が生ずる、従って、熱性けいれんが細胞・分子レベルで海馬に与える影響及び、これがてんかん原生の獲得に関与する可能性を追求することは、てんかんの発症メカニズムを解明する上で重要となる。

苔状線維は歯状回門、及び海馬CA3野に存在する神経細胞とシナプスを形成する、歯状回顆粒細胞の軸索である。苔状線維は通常のシナプスとは異なり、巨大終末(large mossy fiber terminals(LMTs)、直径4-10μm)を有し、CA3の錐体細胞と巨大シナプスを形成する。個々のLMTは数千個ものシナプス小胞を含んでおり、一つの終末には複数のシナプス活性領域が存在し、多いものでは30個を越える。そのため、高頻度の刺激により放出される神経伝達物質の量が増加するfrequency facilitationという現象が生じ、CA3野の神経回路網における興奮、抑制のダイナミクスは顆粒細胞の発火頻度に依存する。すなわち、LMTsにおける可塑的変化は海馬の興奮性と抑制性のバランスに影響を及ぼすことを意味している。

本研究では、乳幼児期に頻発して起こる熱性けいれんが歯状回顆粒細胞の苔状線維、特にLMTsに与える影響を検証した。これは、乳幼児期に経験した熱性けいれんがLMTs形成に異常をきたし、海馬の興奮性上昇を介して将来のてんかん発症に寄与するとの仮説に基づく。私は、熱性けいれんにより異所性LMTsが形成され、成体期まで残存すること、そして異所性LMTsの形成にはcAMP-PKA経路が関与することを明らかにした。

【方法と結果】

1.熱性けいれんによる苔状線維巨大終末数の増加(幼若期)

熱性けいれんがLMTsの形成に影響を及ぼす可能性を検証するため、生後14日齢(P14)のThyl-mGFPマウスにヘアドライヤーを用いて温風をあてることにより体温を上昇させ、けいれん発作を誘導した。熱性けいれんを誘導(HT: hyperthermia)し、1週間後のP21においてCA3錐体細胞層内に形成されたLMTs数を定量した結果、LMTs密度がコントロール(NT: normothermia)群と比較して有意に増加していることが確認された(図1A,B)。熱性けいれんは高熱を誘導することにより、けいれん発作が起こる。そのため、CA3錐体細胞層内におけるLMTsの増加が高熱によるものなのか、もしくはけいれん発作によるものなのかを区別する必要がある。高熱処置15分前に短時間型バルビツレート酸系鎮静薬であるペントバルビタールを投与し、けいれん発作を抑制した。この群をHT-control群とし、LMTs密度を定量した結果、NT群と同程度までLMTs密度は減少した(図1A,B)。この結果は熱ではなく、けいれん発作がCA3錐体細胞層内でのLMTsの形成に必要であることを示唆している。

次に、苔状線維あたりのLMTs密度を定量した。これまでの解析法では、LMTs密度はCA3錐体細胞層内を走行するGFP陽性の線維の数に依存する。熱性けいれんがGFP陽性の細胞数自体を増加させた可能性を排除するため、苔状線維100μmあたりのLMTs数を定量した。LMTs密度は、HT群で有意に増加し、HT-control群で抑制された(図1C,D)。

苔状線維は通常CA3野の明瞭層に投射する。熱性けいれんが明瞭層におけるLMTs数に影響を与える可能性を検証した結果、NT群、HT群間で有意な差はなかった(図1E)。このことからも、熱性けいれんはCA3錐体細胞層内に異所性LMTsを形成することが明らかとなった。また,異所性LMTsが明瞭層内に存在するLMTsと同様の特徴を有するのかを免疫染色法により検討した。異所性LMTsがシナプス小胞関連タンパクであるsynapsin1、及び、Zn2+のトランスポーターであるZnT3を発現することを確認した(図1F)。

2.熱性けいれんによる苔状線維巨大終末数の増加(成体期)

熱性けいれんによるLMTsの増加は、けいれん誘導後1週間という短い期間で生じていた。そのため、この影響が成体期まで残存する可能性を次に検証した。P14で熱性けいれんを誘導し、P60のCA3錐体細胞層内のLMTs密度を定量した結果、HT群で有意に増加し、HT-control群ではNT群と同程度まで減少した(図2A,B)。また、LMTsの大きさを定量した結果、HT群で有意に増加した(図2C)。NT群では、P60でCA3錐体細胞層内のLMTs密度がP21と比較して減少していることを考慮すると、この結果は、幼若期に熱性けいれんによって増加したLMTs数は成体期まで痕跡として残存することを示唆する。

3.cAMPによる苔状線維巨大終末形成の制御

当研究室のこれまでに、過剰興奮状態の誘導により、細胞内のcAMPが上昇することを報告している。また、突起伸長過程においてもcAMPが関与することが知られている。そのため熱性けいれんによるLMTsの形成にcAMPが関与する可能性を考えた。まず、熱性けいれんが細胞内のcAMPを上昇させる可能性を免疫組織化学的に検証した結果、熱性けいれんの誘導6時間後、24時間後にcAMPの蛍光強度が有意に上昇した。次に、LMTsの形成にcAMPが関与する可能性を検証するため、海馬切片培養系を用いて薬理学的に調べた。生後P11-12のThy1-mGFPマウスに熱性けいれんを誘導し、翌日に切片を作製し、7日間培養した。HT群ではNT群と比較して、有意にLMTs密度が増加しており、cAMPのアンタゴニストであるRp-cAMPS(100μM)の処置により、その密度は有意に減少した(図3A,B)。また、NT群由来の切片にRp-cAMPSを処置した際にはLMTs密度に変化は無かった。次に、cAMP-PKA(プロテインキナーゼA)経路がLMTsの形成に関与する可能性を検証するため、PKA阻害剤であるKT5720(10μM)を処置した結果、LMTsはNT群と同程度まで減少した(図3B)。以上の結果は、熱性けいれんによって生じるCA3錐体細胞層内におけるLMTsの過剰形成にはcAMP-PKA経路の活性化が必要であることを示唆している。

4.熱性けいれんによるけいれん発作感受性の増大

熱性けいれんが将来のてんかん発症と関与する可能性を検証するため、けいれん誘導薬であるピロカルピンを処置し、けいれん発作感受性を調べた。P14で熱性けいれんを誘導したマウスに、P60でピロカルピン(280mg/kg)を腹腔内投与した後、80分間行動観察し、けいれん発作スコアを算出した。NT群、HT-control群では、ピロカルピン処置20分後にけいれん発作スコアがピーク(スコア22±0.1,NT;2.3±0.2,HT-control:tremor)に達し、その後は減少した。HT群ではピロカルピン処置5分後からNT、HT-control群と比較して有意にけいれん発作スコアが増加し、60分後にピークに達した(スコア42±0.4:head bobbing、図4A)。また、1固体における発作最大スコアもHT群で有意に高く(図4B)、熱性けいれんがけいれん発作感受性を増大させていることを示唆している。次に、ピロカルピンによるけいれん発作誘導直後に灌流固定をおこない、最初期遺伝子であるFosの免疫染色によって活動した神経細胞数を定量した。CA3錐体細胞層内のFos+細胞の密度は、HT群において有意に増加した(図4C)。また、CA3錐体細胞層内で活動した神経細胞が錐体細胞、もしくは抑制性神経細胞かを区別するため、GAD67(抑制性神経伝達物質GABAの合成酵素)の免疫染色をおこなった。Fos+/GAD67+細胞密度はNT、HT群間で変化はなく、Fos+/GAD67-細胞密度がHT群で有意に増加した(図4D)。このことは、けいれん発作を誘導した際に活動した神経細胞の大部分は抑制性神経細胞ではなく錐体細胞であることを示唆している。

【総括】

本研究において私は、乳幼児期の熱性けいれんによりLMTsの異所形成が生じることを明らかにした。異所形成されたLMTsは成体期まで残存すること、及びLMTsの異所形成にはcAMP-PKA経路の活性化が必要であることを示した。熱性けいれんは、側頭葉てんかん患者の多くが経験しているけいれん発作であり、今回の知見は乳幼児期の神経回路異常が将来にまで維持され、てんかん発症に寄与する可能性を支持するものであり、細胞内シグナルの制御が新たな治療戦略の候補となる可能性を秘めている。

図1. 熱性けいれんによる苔状線維巨大終末の増加

(A)Thy1-mGFPマウスを用いた苔状線維巨大終末(LMTs)の可視化。(B)歯状回門から100μm毎におけるLMTs密度。(C)軸索100μmあたりのLMTs密度。(D)苔状線維がLMTsを形成した割合。(E)明瞭層(SL)におけるLMTs密度。(F)異所性LMTsにおけるsynapsin1、ZnT3の発現。*p<0.05,**p<0.01; Tukey's test after ANOVA。

図2. 成体期における異所性苔状線維巨大終末の出現

(A)成体期(P60)におけるmGFP発現苔状線維巨大終末(LMTs)。矢印はCA3野内の異所性LMTsを示す。(B)歯状回門から100μm毎におけるLMTs密度。**p<0.01; Tukey's test after ANOVA。(C)NT、HT群におけるLMTsサイズの累積度数分布。Kolmogorov-Smirnov test。

図3. 異所性LMTs形成におけるcAMPの関与

(A)培養海馬切片の代表画像、及びトレース像。(B)各群におけるLMTs密度。(C)苔状線維がLMTsを有する割合。(D)CA3錐体細胞層内における苔状線維の長さ。**p<0.01;Tukey's test after ANOVA(B,C)、Kolmogorov-Smirnov test(D)。

図4. 熱性けいれんによるけいれん発作感受性の増加

(A)P14のマウスに熱性けいれんを誘導し、P60でピロカルピン(280mg/kg)を処置した。80分間行動を観察し、けいれん発作スコアを算出した。(B)各個体における最大けいれん発作スコア。(C)Fos、及びNeuNの免疫染色像。NeuN:神経細胞マーカー。*p<0.05,**p<0.01;Tukey's test after ANOVA。NT群、HT群におけるFos+/GAD67+、及びFos+/GAD67-細胞密度。

熱性けいれんは発熱中に起こり、乳幼児が経験する最も一般的なけいれん発作であり、単純型と複雑型が存在する。前者は良性とされている一方で、後者は将来的に側頭葉てんかんの発症へ関与する可能性が示唆されている。側頭葉てんかん患者の海馬では、歯状回における顆粒細胞層の形成異常、顆粒細胞の軸索である苔状線維の異常発芽、抑制性神経細胞の死滅、そしてアンモン角における錐体細胞の死滅及びグリオーシスによる海馬硬化などの病理学的変化が生ずる。従って、熱性けいれんが細胞・分子レベルで海馬に与える影響及び、これがてんかん原生の獲得に関与する可能性を追求することは、てんかんの発症メカニズムを解明する上で重要となる。

苔状線維は歯状回門、及び海馬CA3野に存在する神経細胞とシナプスを形成する、歯状回顆粒細胞の軸索である。苔状線維は通常のシナプスとは異なり、CA3の錐体細胞と巨大なシナプス(LMTs)を形成する。高頻度の刺激により放出される神経伝達物質の量が増加するfrequency facilitationという現象が生じ、CA3野の神経回路網における興奮、抑制のダイナミクスは顆粒細胞の発火頻度に依存することが知られている。

本研究では、乳幼児期に頻発して起こる熱性けいれんが歯状回顆粒細胞の苔状線維、特にLMTsに与える影響を検証し、熱性けいれんにより異所性LMTsが形成され、成体期まで残存すること、そして異所性LMTsの形成にはcAMP-PKA経路が関与することを明らかにした。

熱性けいれんがLMTsの形成に影響を及ぼす可能性を検証するため、生後14日齢(P14)のThy1-mGFPマウスに熱性けいれんを誘導し(HT群)、1週間後にCA3錐体細胞層内に形成されたLMTs密度が対象群(NT群)と比較して有意に増加していることが確認された。熱性けいれんは高熱を誘導することにより、けいれん発作が起こるため、CA3錐体細胞層内におけるLMTsの増加が高熱によるものなのか、けいれん発作によるものなのかを区別するため、ペントバルビタールを投与し、けいれん発作を抑制した(HT-control群)。この群では、LMTs密度は、対象群と同程度までLMTs密度は減少した。けいれん発作がCA3錐体細胞層内でのLMTsの形成に必要であることが示唆された。

次に、苔状線維あたりのLMTs密度を定量した。これまでの解析法では、LMTs密度はCA3錐体細胞層内を走行するGFP陽性の線維の数に依存する。熱性けいれんがGFP陽性の細胞数自体を増加させた可能性を排除するため、苔状線維の単位長あたりのLMTs数を定量した。LMTs密度は、HT群で有意に増加し、HT-control群で抑制された。

苔状線維は通常CA3野の明瞭層に投射する。熱性けいれんが明瞭層におけるLMTs数に影響を与える可能性を検証した結果、NT群、HT群間で有意な差はなかった。このことからも、熱性けいれんはCA3錐体細胞層内に異所性LMTsを形成することが明らかとなった。また、異所性LMTsが明瞭層内に存在するLMTsと同様の特徴を有するのかを免疫染色法により検討した。異所性LMTsがシナプス小胞関連タンパクであるsynapsin1、及び、Zn2+のトランスポーターであるZnT3を発現することを確認した。

熱性けいれんによるLMTsの増加は、けいれん誘導後1週間という短い期間で生じていた。そのため、この影響が成体期まで残存する可能性を次に検証した。P14で熱性けいれんを誘導し、P60のCA3錐体細胞層内のLMTs密度を定量した結果、HT群で有意に増加し、HT-control群ではNT群と同程度まで減少した。また、LMTsの大きさを定量した結果、HT群で有意に増加した。NT群では、P60でCA3錐体細胞層内のLMTs密度がP21と比較して減少していることを考慮すると、この結果は、幼若期に熱性けいれんによって増加したLMTs数は成体期まで痕跡として残存することを示唆する。

これまでに、過剰興奮状態の誘導により、細胞内のcAMPが上昇することを報告している。また、突起伸長過程においてもcAMPが関与することが知られている。そのため熱性けいれんによるLMTsの形成にcAMPが関与する可能性を考えた。まず、熱性けいれんが細胞内のcAMPを上昇させる可能性を免疫組織化学的に検証した結果、熱性けいれんの誘導6時間後、24時間後にcAMPの蛍光強度が有意に上昇した。次に、LMTsの形成にcAMPが関与する可能性を検証するため、海馬切片培養系を用いて薬理学的に調べた。生後P11-12のThy1-mGFPマウスに熱性けいれんを誘導し、翌日に切片を作製し、7日間培養した。HT群ではNT群と比較して、有意にLMTs密度が増加しており、cAMPのアンタゴニストであるRp-cAMPS(100μM)の処置により、その密度は有意に減少した。また、NT群由来の切片にRp-cAMPSを処置した際にはLMTs密度に変化は無かった。次に、cAMP-PKA(プロテインキナーゼA)経路がLMTsの形成に関与する可能性を検証するため、PKA阻害剤であるKT5720(10μM)を処置した結果、LMTsはNT群と同程度まで減少した、以上の結果は、熱性けいれんによって生じるCA3錐体細胞層内におけるLMTsの過剰形成にはcAMP-PKA経路の活性化が必要であることを示唆している。

熱性けいれんが将来のてんかん発症と関与する可能性を検証するため、けいれん誘導薬であるピロカルピンを処置し、けいれん発作感受性を調べた。P14で熱性けいれんを誘導したマウスに、P60でピロカルピン(280mg/kg)を腹腔内投与した後、80分間行動観察し、けいれん発作スコアを算出した。NT群、HT-control群では、ピロカルピン処置20分後にけいれん発作スコアがピーク(スコア2.2±0.1,NT;2.3±0.2,HT-control:tremor)に達し、その後は減少した。HT群ではピロカルピン処置5分後からNT、HT-control群と比較して有意にけいれん発作スコアが増加し、60分後にピークに達した(スコア4.2±0.4:head bobbing)。

また、1個体における発作最大スコアもHT群で有意に高く、熱性けいれんがけいれん発作感受性を増大させていることを示唆している。次に、ピロカルピンによるけいれん発作誘導直後に灌流固定をおこない、最初期遺伝子であるc-Fosの免疫染色によって活動した神経細胞数を定量した。CA3錐体細胞層内のFos+細胞の密度は、HT群において有意に増加した。また、CA3錐体細胞層内で活動した神経細胞が錐体細胞、もしくは抑制性神経細胞かを区別するため、GAD67(抑制性神経伝達物質GABAの合成酵素)の免疫染色をおこなった。Fos+/GAD67+細胞密度はNT、HT群間で変化はなく、Fos+/GAD67-細胞密度がHT群で有意に増加した。このことは、けいれん発作を誘導した際に活動した神経細胞の大部分は抑制性神経細胞ではなく錐体細胞であることを示唆している。

本研究では、乳幼児期の熱性けいれんによりLMTsの異所形成が生じることを明らかにした。異所形成されたLMTsは成体期まで残存すること、及びLMTsの異所形成にはcAMP-PKA経路の活性化が必要であることを示した。熱性けいれんは、側頭葉てんかん患者の多くが経験しているけいれん発作であり、今回の知見は乳幼児期の神経回路異常が将来にまで維持され、てんかん発症に寄与する可能性を支持するものであり、細胞内シグナルの制御が新たな治療戦略の候補となる可能性を秘めている。従って、博士(薬学)の授与に値すると判断された。